A possible molecular mechanism for parasitic inhibition by lactoferrin

Abstract

Transferrins (Tfs) belong to a family of iron-binding glycoproteins possessing similar aminoacid sequence though they have different biological functions and locations. Lactoferrin (Lf) is expressed and secreted from glandular epithelial cells and from mature neutrophiles of mammalian and it is an important component of the aspecific host defence or natural immunity, including resistance to parasitic infections. Serum transferrin (sTf) is synthesized by the liver of mammals and secreted into the blood stream; its primary function is iron transport. Ovotransferrin (Otrf), synthesized by avians, displays both iron transport and protective functions. Parasites synthesize papain-like cysteine proteases that are relevant for the virulence and pathogenicity of parasites, being involved in several aspects of the parasite life cycle, it is therefore possible that the antiparasitic activity of Lf could be due to the inhibition of parasitic papain-like cysteine protease that we have recently observed. In this study we have investigated the thermodynamic parameters of hLf, bLf and Otrf inhibition of the parasitic papain-like type I cysteine proteases from Leishmania infantum, Trypanosoma cruzi and Trypanosoma brucei. bLf, hLf and Otrf, both in the apo- and olo-forms, showed time- and concentration-dependent inhibition of the catalytic activity of papain and of type I proteases from L.infantum, T. cruzi and T. brucei. The KI values observed for bLf and hLf inhibition of L. infantum, T. cruzi and T. brucei proteases were in the nanomolar range (KI = 3.1 nM), lower than KI values observed for papain inhibition (KI = 24 nM). Otrf showed lower inhibition of cysteine proteases (KI = 0.6 µM). On the contrary, sTf did not display any inhibition towards parasitic proteases, according to its different role in mammals. The inhibition of parasitic cysteine proteases by hLf, bLf and Otrf appeared to conform to a competitive mechanism. The observed pH optimum for bLf inhibition of parasitic proteases was around neutrality, while it was acidic for hLf and alkaline for Otrf. The further quantitative analysis of pH dependence of the intrinsic ligand-independent inhibition constant KI allowed the evaluation of pKa values that define the acid-base equilibrium of amino acidic residue(s) modulating the enzyme(s)-inhibitor recognition events. SDS-PAGE showed that hLf, bLf and Otrf were easily degraded by either papain or parasitic type I protease during the assay incubation time (few minutes) and it is likely that one or more protease inhibitory peptides were generated from protein hydrolysis. As a matter of fact, a sequence present near the C-terminus of human (hLf) and bovine (bLf) lactoferrin shows homology with the sequence of the active site of cystatins, which are competitive inhibitors of papain-like cysteine proteases. The same sequence is present, though with lower homology, in Otrf and, with even lower homology, in sTf. Therefore, we have charactherized by MALDI-TOF the profile of Lf cleavage by papain and preliminary data suggest the presence of a cystatin-like peptide in two proteolytic fragments of hLf and in one proteolytic fragment of bLf.

Le transferrine (Tfs) sono una famiglia di glicoproteine in grado di legare reversibilmente il ferro, e presentano un’elevata omologia di sequenza tra tutti i membri di questa famiglia. In particolare la lattoferrina (Lf) è prodotta e secreta nelle cellule ghiandolari epiteliali ed è presente nei granuli dei granulociti neutrofili dei mammiferi. Essa rappresenta un’importante componente della difesa immunitaria aspecifica dell’ospite. La siero transferrina (sTf) invece è sintetizzata nel fegato, ed è coinvolta unicamente nel trasporto del ferro. L’ovotransferrina (Otrf), l’omologa aviaria della Lf , svolge sia una funzione di difesa che di trasporto del ferro. Le proteasi a cisteina papaina-simili da protozoi e metazoi parassiti, secretorie e di membrana, partecipano ai processi di morfogenesi degli organismi patogeni, sono implicate nell’invasione delle cellule e dei tessuti da parte dei parassiti, riducono la risposta immunitaria dell’ospite e costituiscono uno dei fattori più rilevanti nelle patologie associate alle infestazioni da parassiti. Pertanto, a fronte della capacità della Lf di svolgere un’azione antiparassitaria, noi abbiamo ipotizzato che la Lf possa svolgere tale azione grazie all’inattivazione delle suddette proteasi a cisteina. Nel presente lavoro abbiamo studiato le proprietà termodinamiche dell’inibizione delle proteasi a cisteina di alcuni parassiti, quali Leishmania infantum, Tripanosoma cruzi e Trypanosoma brucei. Tale studio è stato esteso anche verso la papaina, capostipite di questa famiglia. Innanzitutto è emerso una maggiore affinità delle transferrine studiate (bLf, hLf e Otrf, in forma apo e olo) verso le proteasi parassitarie (KI = 3.1 nM) rispetto a quella verso la papaina (KI = 24 nM). Otrf risulta essere l’inibitore con minore affinità (KI = 0.6 µM). Inoltre è emerso che la sTf non è in grado di svolgere un’azione inibitoria, coerentemente con la sua funzione nei mammiferi. L’inibizione di tutte le proteasi risulta essere conforme ad un meccanismo di inibizione competitivo. Da un’analisi della dipendenza del pH dei suddetti fenomeni di inibizione si è osservato una maggiore attività della bLf a pH fisiologico mentre la hLf inibisce più efficacemente a valori di pH acidi (pH = 5.0) e la Otrf a valori di pH alcalini (pH = 9.0). La dipendenza dal pH del parametro KI relativo all’interazione degli inibitori studiati con gli enzimi, ha permesso di evidenziare la variazione di diversi valori di pKa, ascrivibili ad eventi di protonazione e deprotonazione di differenti gruppi ionizzabili. Inoltre si è osservato, a seguito di SDS-page, una parziale idrolisi della Lf e della Otrf durante diverse incubazioni con la papaina e con le proteasi parassitarie, e l’insieme di tali dati suggerisce la liberazione di un peptide, che può quindi inibire competitivamente le suddette proteasi a cisteina. A supporto di tale ipotesi, si è osservato in presenza della porzione C-terminale della Lf, una sequenza aminoacidica che presenta un’elevata omologia con il sito attivo delle cistatine, una (super)famiglia di proteina, riconosciute essere gli inibitori reversibili per eccellenza delle proteasi a cisteina papaina-simili. Abbiamo quindi caratterizzato, mediante MALDI TOF, il profilo di idrolisi della Lf ad opera della papaina, ed è stata riscontrata la presenza di frammenti contenenti tale sequenza cistatinosimile, sia nella bLf che nell’hLf.