The role of mitotic spindle alterations in the induction of apoptosis

Abstract

Microtubules, together with actin and intermediate filaments are the major components of the cytoskeleton of eukaryotic cells and play a critical role in many cellular processes, including cell division, cell motility, intracellular trafficking, and cell shape maintenance. The principal Microtubule Organizing Center (MTOC) in mammalian cells is the centrosome that is composed of a pair of centrioles surrounded by an osmiophilic matrix termed pericentriolar material (PCM). As the microtubule network is highly involved in cell proliferation, it appeared to be a preferential target for cancer therapy. Microtubule Damaging Agents (MDA) represent an important class of anticancer drugs. Although some of this agents promote microtubules stabilization and other induce microtubules disruption, all MDA share the common property of suppressing microtubules dynamics, and thereby microtubules function, leading to the disruption of the mitotic spindle and the blockade of cell cycle progression at the transition from metaphase to anaphase that leads to apoptosis or mitotic catastrophe commitment. Mitotic catastrophe has been described as cell death that occurs from metaphase of mitosis in response to agents that cause mitotic-spindle damage. Recently we focused our attention on the antineoplastic spindle poison agent combretastatin-A4 (CA-4). CA-4 is an MDA isolated from the South African tree Combretum Caffrum that is not recognized by the multi drug resistance pump, a cellular pump which rapidly ejects foreing molecules including many anticancer drugs. MDAs also promote several effects on the centrosome including abnormal centrioles structure, centrosome fragmentation and inappropriate centrosome duplication. CA-4 is able to arrest cells at mitosis in a dose depending manner accompanied by an increasing disorganization of chromosomal arrangement, led to formation of particular structure named 'star-like'. This structures contain pericentrosomal matrix components like γ-tubulin, pericentrin and ninein. Confocal and immunofluorescence microscopy revealed that 'star like' structure are spherical structure formed by residual fragments of microtubules connected to kinetochore. At the centre of this structure are present some component of the pericentriolar matrix like γ-tubulin, pericentrin and ninein. Treatment with CA-4, which produced high frequency of 'star-like' mitosis, was accompanied by mitotic catastrophe commitment characterized by activation of caspases-3/-9 and DNA fragmentation. The mechanisms that lead from microtubules depolymerization to cell death are still not completely clear. Recently it has been demonstrated that Bim, a proapoptotic Bcl-2 protein, is associated to the dynein motor complex and sequestered by microtubules. MDA, through the alteration of microtubules structure, might lead to the release of Bim from cytoskeleton and to its translocation to the mitochondria. Moreover, recent data show that further mechanisms might be at the base of Bim-induced apoptosis such as regulation of Bim transcriptional levels. In a similar way, p53 another well known pro-apoptotic molecule, is associated with cellular microtubules and is transported to the nucleus by dynein. Based on these data, we have investigated whether upon tubulin depolymerization, Bim and p53 could be involved, and eventually in which manner, in the first steps of apoptosis. CA-4 treatment induce the release of Bim from microtubules and its increase at transcriptional level. In addition, Bim silencing strongly reduced apoptotic commitment. It has recently reported that p53 can also induce apoptosis independently of new protein synthesis however the functional importance of p53 in MDA-induced apoptosis of human cancer cells remain poorly understood. Concerning the role of p53 in CA-4-induced apoptosis, we found that treatment determined its release from cytoskeleton and re-localization to mitochondria. Data obtained from this study showed that Combretastatin-treated H460 cells are killed via a mitotic catastrophe mechanism strictly dependent on the achievement of mitotic block, caspases activation and Bim and p53 translocation to mitochondria.

I microtubuli, insieme con l'actina e i filamenti intermedi sono i principali componenti del citoscheletro delle cellule eucariotiche e svolgono un ruolo fondamentale in molti processi cellulari: divisione, motilità, 'trafficking' e mantenimento della forma cellulare. Il principale Centro Organizzatore dei Microtubuli (MTOC) nelle cellule di mammifero è il centrosoma che è composto da una coppia di centrioli circondata da una matrice elettron-densa chiamata materiale pericentriolare (PCM). Essendo i microtubuli fortemente coinvolti nei processi di divisione cellulare, rappresentano un target preferenziale nella terapia del cancro. Gli agenti che danneggiano i microtubuli (MDA) rappresentano una importante classe di farmaci antitumorali e benchè alcune di queste sostanze promuovano la stabilizzazione dei microtubuli e altre inducano la depolimerizzazione, tutti gli MDA presentano la caratteristica comune di sopprimere la dinamica e quindi la funzione dei microtubuli. In questo modo gli MDA causano la distruzione del fuso mitotico e un blocco nella progressione del ciclo cellulare nella transizione metafase-anafase che puo. portare all.attivazione dei pathways apoptotici e alla catastrofe mitotica. Quest'ultima è stata descritta recentemente come una morte cellulare che avviene durante la mitosi in seguito all.utilizzo di agenti che causano alterazioni del fuso mitotico. Recentemente abbiamo focalizzato la nostra attenzione sulla Combetastatina (CA-4), un MDA isolato dal Combretum Caffrum, un albero sud Africano che ha la caratteristica di non essere riconosciuta dalla pompa Multi Drug Resistance, una pompa cellulare che elimina rapidamente sostanze estranee inclusi molti farmaci antitumorali. Gli MDA agiscono inoltre anche sul centrosoma causando alterazioni strutturali, frammentazione e inappropiata duplicazione del centrosoma. La CA-4 è in grado di arrestare le cellule in mitosi causando, in maniera dipendente dalla concentrazione, un aumento della disorganizzazione dell.arrangiamento cromosomico e la formazione di particolari strutture chiamate 'star-like'. L'analisi in microscopia a fluorescenza e confocale ha evidenziato che le 'star-like' sono strutture di forma sferica formate da piccoli fasci di microtubuli connessi al cinetocore. Al centro di queste strutture sono presenti alcuni componenti della matrice pericentriolare come la γ-tubulina, la pericentrina e la nineina. Il trattamento con la CA-4, oltre a determinare alterazioni di tipo strutturale, causa morte cellulare per catastrofe mitotica caratterizzata dall.attivazione delle caspasi-3/-9 e dalla frammentazione del DNA. Il meccanismo che porta dalla depolimerizzazione dei microtubuli alla morte cellulare non è ancora completamente chiarito. Recentemente è stato dimostrato che Bim, una proteina pro-apoptotica appartenente alla famiglia Bcl-2, è associata con il motore proteico dineina e sequestrata quindi dai microtubuli. Gli MDA, attraverso l'alterazione della struttura dei microtubuli, potrebbero causare il rilascio di Bim dal citoscheletro e la sua traslocazione sul mitocondrio. Inoltre dati recenti mostrano che esistono altri meccanismi che regolano Bim come la regolazione trascrizionale. Allo stesso modo, p53, una proteina pro-apoptotica molto conosciuta è associata con i microtubuli ed utilizza il motore proteico dineina per essere trasportata nel nucleo ed agire come fattore di trascrizione. Basandoci su questi dati abbiamo valutato il coinvolgimento di Bim e di p53 nell.apoptosi indotta in seguito al trattamento con CA-4. Il trattamento con la CA-4 determina sia il rilascio dai microtubuli sia un aumento del livello trascrizionale di Bim. Inoltre il silenziamento di Bim riduce fortemente l.attivazione della caspasi-3, una delle caspasi effettrici del pathway apoptotico mitocondriale. Inoltre, recentemente è stato dimostrato che p53 puo. indurre apoptosi non solo agendo come fattore di trascrizione ma anche attraverso una azione indipendente dalla trascrizione grazie alla capacità di interagire direttamente con proteine della famiglia Bcl-2 presenti sul mitocondrio come Bcl-2 e Bcl-Xl. Comunque l'importanza dell'attività indipendente dalla trascrizione di p53 dopo utilizzo degli MDA su cellule tumorali rimane poco compresa e studiata. Nei nostri esperimenti abbiamo verificato che il trattamento con la combretastatina causa una variazione nel legame di p53 con la dineina e parallelamente determina la presenza di tale proteina sul mitocondrio. Inoltre esperimenti di coimmunoprecipitazione rivelano che Bim e p53 interagiscono sul mitocondrio e sono probabilmente responsabili dell.attivazione del pathway mitocondriale apoptotico. I nostri dati indicano quindi che cellule H460 trattate con la combretastatina sono uccise attraverso il meccanimo della catastrofe mitotica dipendente da un prolungato arresto mitotico, attivazione delle caspasi e traslocazione mitocondriale di Bim e p53.