Investigation on the biogenesis of macromolecules in prebiotic environments

Abstract

Prebiotic chemistry is a field which attempts to recreate the pathways of chemical synthesis which led to the formation of biological molecules, and ultimately the origin of life. In experiments of prebiotic chemistry (using conditions that existed on Earth before the appearance of primitive life), researchers were able to synthesize amino acids and short peptides, but never nucleic acids and mononucleotides. The catalytic activity of several short peptides was recently described in literature; some of these peptides are short enough to be considered prebiotically plausible. One of these is the dipeptide SerHis (Li et al. 2000), which has broad hydrolytic activity and is capable of hydrolyzing proteins, nucleic acids and esters. By virtue of its catalytic activity in hydrolysis reactions, the dipeptide SerHis must necessarily be capable of catalyzing the reverse reaction, i.e. the formation of esterlinkages, phosphodiesters and peptides. In fact, it is well known that the condensation reactions and the hydrolysis are each the opposite of the other, and can be catalyzed by a single chemical species. This has already been demonstrated in the case of enzymes such as chymotrypsin. Therefore, it is expected that SerHis is capable of catalyzing the condensation between the appropriate reagents, where the thermodynamic conditions are favorable for the formation of a condensation product. This hypothesis was verified experimentally in work done in the research group where I did my thesis, where it was proven that SerHis catalyzes the formation of peptide bonds between activated amino acids (Gorlero et al. 2009). The purpose of this study was to explore the capabilities of catalysis by the dipeptide SerHis of the oligomerization of nucleic acids, primarily RNA. To investigate the conditions required for this reaction, we have studied the condensation reaction, the properties of the catalyst, and the possible mechanism of catalysis. The environment used for the reactions described here consists of an eutectic phase. The eutectic mixture used in this study is a two-phase system consisting of an aqueous solution of reagents and ice, kept at -18 °C. From a physical point of view, an eutectic mixture is composed of microdispersed liquid solution including extensive areas of ice. Under these conditions, consistent with scenarios of the early Earth, the compartmentalization of solutes in the liquid results in the upconcentration of solutes, which are excluded from the ice. Moreover, because of the reduced thermodynamic activity of water in liquid phase, this microcompartimentalization promotes condensation reactions (involving a loss of water as a reaction product) as those required for the formation of nucleic acids promoted by the SerHis dipeptide. The catalysis of the polymerization reaction of nucleic acids was successful; in standard conditions, the maximum yield obtained by the polymerization catalyst, SerHis, was around 10%. The reaction runs successfully in a wide range of experimental parameters, which reflect several plausible prebiotic environmental conditions: in different conditions of pH (5.0 to 8.2), in different buffers, with different imidazoles, and using various monomers of RNA and DNA. The catalytic properties of SerHis depend on the structural arrangement of its functional groups, strikingly, the isomeric dipeptide HisSer has no measurable catalytic activity. SerHis activity is detectable down to very low concentrations - 8 μM - a thousand times smaller than the substrate concentration. In addition, it was shown that SerHis is capable of multiple turnovers - a mechanism typical of enzymes. Regarding the study of the mechanism, an intermediate product was isolated and characterized by mass spectrometry. It appears to be a covalent bond between SerHis and the substrate from the reaction (activated mononucleotide). This intermediate, when allowed to react again, decomposes into SerHis (which continues to catalyze the reaction), and nucleic acid oligomers. On the basis of the data obtained, hypothesis for the chemical structure of the intermediate and the mechanism of the reaction were formed. The fact that SerHis can catalyze the formation of RNA is of great importance to the field of prebiotic chemistry. In fact, a major obstacle in the RNA world hypothesis stems from the implausibility of synthetic pathways of oligo- and poly-merization of RNA. Accordingly, its emergence remains an open question in the origin of life. As shown in this thesis, the ability of small peptides (which are prebiotic) to perform the oligomerization or polymerization of RNA can offer a plausible scenario that links the chemical and prebiotic RNA world. You can then imagine, in principle, a step by step pathway from the spontaneous chemical prebiotic synthesis of amino acids and small peptides to the RNA world, and then to life as we know it today. It is important to note that just as small peptides can catalyze the formation of oligonucleotides from nucleotides, it is conceivable that several fragments of oligonucleotides can then be combined to give polynucleotides, in order to obtain long chains of ribonucleic acid. In addition, this study allows for a greater understanding of the origin of life and the origins of enzyme catalysis. This work has shown that even a peptide of only two amino acids can present enzymatic properties. This shows that the selection which led to enzymes - highly efficient catalysts - may have begun at a very early stage of chemical evolution.

La chimica prebiotica e un campo nel quale si cerca di ricreare il percorso di sintesi chimica che ha portato alla formazione di molecole biologiche, e in ultima analisi all’origine della vita. Negli esperimenti di chimica prebiotica (utilizzando condizioni che erano presenti sulla Terra prima della comparsa della vita primitiva) i ricercatori sono stati in grado di sintetizzare amminoacidi e peptidi brevi, ma non acidi polinucleici e mononucleotidi. L'attivita catalitica di diversi peptidi brevi e stata recentemente descritta in letteratura. Alcuni di questi peptidi sono sufficientemente brevi da essere considerati prebioticamente plausibili. Uno di questi e il dipeptide SerHis (Li et al. 2000), che ha un'ampia attivita idrolitica ed e' in grado di idrolizzare proteine, acidi nucleici ed esteri. In virtu delle sua attivita catalitica nelle reazioni di idrolisi, il dipeptide SerHis deve necessariamente poter catalizzare la reazione inversa, cioe la formazione di legami esterei, fosfodiesterei e peptidici. Infatti, e ben noto che le reazioni di condensazione e quelle di idrolisi sono l’una l’opposto dell’altra, e possono essere catalizzate da una stessa specie chimica. Cio e gia stato dimostrato nel caso di enzimi come la chimotripsina. Pertanto, ci si aspetta che SerHis sia in grado di catalizzare la condensazione tra opportuni reagenti, laddove le condizioni termodinamiche diventino favorevoli alla formazione di un prodotto di condensazione. Questa ipotesi e stata verificata sperimentalmente in un lavoro svolto nel gruppo di ricerca in cui ho svolto la tesi, dove e stato provato che SerHis catalizza la formazione di legami peptidici tra amminoacidi attivati (Gorlero et al. 2009). Lo scopo di questo lavoro e stato quello di esplorare le capacita' di catalisi da parte del dipeptide SerHis nei confronti della oligomerizzazione di acidi nucleici, principalmente RNA. Per indagare le condizioni richieste per questa reazione, sono state studiate la reazione di condensazione, le proprieta del catalizzatore, e il possibile meccanismo di catalisi. L'ambiente utilizzato per le reazioni qui descritte consiste in un eutettico. La miscela eutettica utilizzata in questo lavoro e un sistema bifasico composto da una soluzione acquosa dei reagenti e da ghiaccio, mantenuti alla temperatura di -18 °C. Dal punto di vista fisico, una miscela eutettico e composta da microcanali di soluzione liquida dispersi tra estese zone di ghiaccio. In tali condizioni, compatibili con possibili scenari della Terra primordiale, si ottiene la compartimentalizzazione dei soluti nella microfase liquida con conseguente sovraconcentrazione dei soluti, che vengono esclusi dal ghiaccio. Inoltre, a causa del ridotta attivita termodinamica dell’acqua nella fase liquida, tale microcompartimentalizzazione favorisce reazioni di condensazione (che implicano una perdita di acqua come prodotto di reazione) come quelle richieste per la formazione di acidi nucleici promossa dal dipeptide SerHis. La catalisi della reazione di polimerizzazione degli acidi nucleici ha avuto esiti positivi. In condizioni standard, la resa massima di polimerizzazione ottenuta con il catalizzatore SerHis era intorno al 10%. La reazione decorre con successo in un ampio range di parametri sperimentali, che riflettono diverse condizioni ambientali plausibili prebioticamente: in diverse condizioni di pH (5,0-8,2), in tamponi diversi, con diversi derivati dell’imidazolo, e utilizzando diversi monomeri di RNA e DNA. Le proprieta di SerHis dipendono dalla disposizione strutturale dei suoi gruppi funzionali; sorprendentemente il dipeptide isomerico HisSer non ha un’attivita catalitica misurabile. L'attivita di SerHis e rilevabile fino a concentrazioni molto basse - 8 μM, mille volte inferiore alla concentrazione del substrato. Inoltre, e stato dimostrato che SerHis e capace di consentire un meccanismo a turnover tipico degli enzimi. Per quanto riguarda lo studio del meccanismo, e stato isolato un prodotto intermedio e caratterizzato attraverso la spettrometria di massa. Risulta essere un addotto covalente tra SerHis e il substrato di reazione (un mononucleotide attivato). Questo intermedio, posto nuovamente a reagire, si decompone in SerHis (che continua a catalizzare la reazione), e oligomeri di acidi nucleici. Sulla base dei dati ottenuti, sono state fatte delle ipotesi sulla struttura chimica dell’intermedio e sul meccanismo di reazione. Il fatto che SerHis puo catalizzare la formazione di RNA e di grande importanza nel campo della chimica prebiotica. Infatti, un notevole ostacolo all'ipotesi del mondo RNA deriva dalla non plausibilita delle vie sintetiche di oligo- e polimerizzazione dell’RNA. Pertanto il suo emergere resta una domanda aperta nel campo dell’origine della vita. Come mostrato in questa tesi, la capacita di piccoli peptidi (che sono in effetti prodotti prebiotici) di oligomerizzare o polimerizzare l'RNA permette di proporre uno scenario verosimile che collega la chimica prebiotica e il mondo RNA. Si puo quindi immaginare, in linea di principio, un percorso graduale dalla chimica prebiotica della sintesi spontanea di amminoacidi e di piccoli peptidi, al mondo dell’RNA, e quindi verso la vita cosi come lo conosciamo oggi. E’ importante notare che cosi come piccoli peptidi possono condensare nucleotidi a dare oligonucleotidi, e plausibile pensare che piu frammenti di oligonucleotidi possano combinarsi a dare polinucleotidi, in modo da ottenere lunghe catene di acido ribonucleico. Inoltre, questo studio ci consente una maggior compresione del fenomeno dell'origine della vita e delle origini della catalisi enzimatica. Questo lavoroha provatoche un peptide di due soli amminoacidi puo' gia presentare proprieta enzimatiche. Cio dimostra che la selezione verso gli enzimi - catalizzatori altamente efficiente, potrebbe aver avuto inizio in una fase molto precoce di evoluzione chimica.