Exosomes in the pathogenesis of HIV-1

Abstract

Cells secrete various membrane-enclosed microvesicles from their cell surface (shedding microvesicles) and from internal, endosome-derived membranes (exosomes). Intriguingly, these vesicles have many characteristics in common with viruses, including biophysical properties, biogenesis, and uptake by cells. Recent discoveries describing the microvesicle-mediated intercellular transfer of functional cellular proteins, RNAs, and mRNAs have revealed additional similarities between viruses and cellular microvesicles. Apparent differences include the complexity of viral entry, temporally regulated viral expression, and self-replication proceeding to infection of new cells. Interestingly, many virally infected cells secrete microvesicles that differ in content from their virion counterparts but may contain various viral proteins and RNAs. Accumulative findings have demonstrated that exosomes highly resembled HIV-1 particles in many aspects, from their physical properties to composition. The similarity of the composition (i.e., lipids, proteins, carbohydrates, and RNAs) between viral particles and exosomes suggests that exosomes may play an indispensable role in HIV-1 pathogenesis. Infact, HIV-1 infected cells release exosomes associating viral proteins, such as Nef and Gag, and RNA. Their potential functions during HIV-1 infection are just beginning to emerge. The main aim of this PhD thesis is the analysis of possible influence of exosomes released from HIV-1 infected cells on different stages of viral infection: in the primary infection, in HIV-1 infection during the cART (combination anti-retroviral therapy) and in HIV-1 latency, the major hurdle toward HIV-1 eradication. As CD4+ T lymphocytes are the major target of HIV-1 infection and replicate HIV-1 when activated, but resist HIV-1 replication when they are in a quiescent/resting state, the first aim of the PhD project has been the analysis in primary infection and under cART of the effects of exosomes from HIV-1 infected cells on activation state of quiescent CD4+ T lymphocytes and their susceptibility to HIV-1 infection. However, it has been reported that exosomes from cells expressing Nef upload activated ADAM17, a disintegrin and metalloprotease, which converts the pro-TNF-α in its mature form, and induce release of TNF-α from unstimulated peripheral blood mononuclear cells (PBMCs). We investigated whether a similar mechanism occurs in resting CD4+ T lymphocytes challenged with exosomes from HIV-1 infected cells and the possible consequences in terms of HIV-1 replication. First, we confirmed that cells infected with either replication-competent or defective HIV-1 release exosomes, uploading activated ADAM17. Next, we demonstrated that in HIV-1 primary infection and during cART these "armed” nanovesicles induce cell activation and render resting human primary CD4+ T lymphocytes permissive to HIV-1 replication. We found that the expression of HIV-1 Nef in exosome-producing cells is both necessary and sufficient for cell activation as well as HIV-1 replication in target CD4+ T lymphocytes. We also identified a Nef protein domain important for the effects we observed, i.e., the 62EEEE65 acidic cluster domain. The data presented here are consistent with a model where Nef induces intercellular communication through exosomes to activate bystander quiescent CD4+ T lymphocytes, thus stimulating viral spread. Overall, our findings support the idea that HIV-1 in primary infection and under cART infection evolved to usurp the exosome-based intercellular communication network to favor its spread in infected hosts. In the second part of this thesis we analyzed the effects of exosomes release from HIV-1 infected cells on viral latency. HIV-1 latency is the major hurdle toward HIV-1 eradication. Infact, HIV-1 infection is efficiently counteracted by cART which, despite preventing disease progression, does not eradicate virus infection which persists in a latent form. The latent reservoir is generated by virus entry in activated CD4+ T lymphocytes committed to return to a resting state, even though also resting CD4+ T lymphocytes can be latently infected. Thus, we may assume that HIV-1 reservoir is prevalently composed by memory CD4+ T lymphocytes. We asked whether exosomes from cells infected with either replication-competent or defective HIV-1 can activate latent HIV-1 in CD4+ T lymphocytes. Our results demonstrated that latent HIV-1 can be activated by TNFα released by cells upon ingestion of exosomes released by infected cells, and that this effect depends on the activity of exosome-associated ADAM17. These pieces of evidence shed new light on the mechanism of HIV-1 reactivation in latent reservoirs, and might also be relevant to design new therapeutic interventions focused on HIV-1 eradication.

Le cellule eucariotiche rilasciano nello spazio extracellulare differenti tipologie di vescicole: le vescicole rilasciate dalla membrana plasmatica, “shedding microvesicles”, e gli esosomi, derivanti dalle membrane endosomiali interne. E’ interessante notare che le microvescicole rilasciate dalle cellule hanno molte caratteristiche in comune con le particelle virali: alcune proprietà biofisiche, la biogenesi e l'uptake da parte delle cellule target. Recenti evidenze sperimentali che descrivono il trasferimento intercellulare di proteine funzionali, RNA e mRNA mediante microvescicole, hanno evidenziato altre numerose analogie tra le particelle virali e microvescicole cellulari. Le differenze principali comprendono la complessità del meccanismo di uptake virale, l’espressione regolata di prodotti virali, il budding e l’infezione di cellule bystander. È di notevole importanza evidenziare che molte cellule infettate da virus rilasciano esosomi che differiscono nel complesso dagli omologhi virioni, ma possono contenere numerose proteine e RNA virali. Numerosi studi hanno dimostrato che esosomi cellulari hanno molte caratteristiche in comune con le particelle dell’HIV-1. Quest’analogia, soprattutto per quanto riguarda la composizione (ad esempio, lipidi, proteine, carboidrati, e RNA) suggerisce che esosomi cellulari potrebbero svolgere un ruolo indispensabile nella patogenesi del retrovirus. Infatti, le cellule infettate dall’HIV-1 rilasciano esosomi che contengono alcune proteine, come Nef e Gag, e RNA virali e negli ultimi anni sta emergendo la loro funzione durante l'infezione. Lo scopo principale di questo lavoro di dottorato è quello di analizzare l’influenza del rilascio esosomiale da parte di cellule infettate in diverse fasi dell’infezione virale: nell’infezione primaria, nell’infezione durante la terapia combinata anti-retrovirale (cART) e durante la fase di latenza del retrovirus, il maggiore ostacolo verso l'eradicazione dell'HIV-1. Dal momento che i linfociti T CD4+ sono le principale cellule bersaglio per l’HIV-1, ma resistono alla replicazione virale quando sono in uno stato quiescente, il primo obiettivo del lavoro è stato l'analisi degli effetti degli esosomi rilasciati da cellule infette sull’attivazione dei linfociti quiescenti T CD4+ e la loro suscettibilità all’infezione. Gli effetti degli esosomi rilasciati sono analizzati con modelli differenti per l’infezione primaria e durante la terapia cART. Inoltre, dal momento che è stato riportato che gli esosomi rilasciati da cellule esprimenti Nef contengono la forma attiva della disintegrina e metalloproteasi ADAM17, la cui funzione principale è quella di convertire il pro-TNF-α nella sua forma matura, nel nostro lavoro abbiamo analizzato se un meccanismo simile si verifichi nei linfociti T CD4+ quiescenti trattati con esosomi e le possibili conseguenze in termini di replicazione virale. Dopo aver confermato che gli esosomi rilasciati da cellule infettate con l’HIV-1, contengono la forma attiva di ADAM17, abbiamo dimostrato che nell’infezione primaria e durante cART le nanovescicole inducono uno stato di attivazione e rendono i linfociti T CD4+ quiescenti permissivi alla replicazione virale. Inoltre, è stato evidenziato che l'espressione della proteina virale Nef nelle cellule producenti esosomi è necessaria e sufficiente per l'attivazione delle cellule così come per la replicazione dell'HIV-1 nei linfociti T CD4+. Per di più, è stato anche identificato un dominio della proteina Nef, il cluster acido 62EEEE65, importante per gli effetti che abbiamo osservato.I risultati qui presentati, quindi, suggeriscono che Nef induce un rilascio di esosomi a livello intercellulare per attivare i linfociti T CD4+ quiescenti, stimolando così la replicazione del retrovirus. Nel complesso, i nostri dati supportano l'idea che l'HIV-1 sia nell’infezione primaria e sia nell’infezione sotto terapia abbia evoluto un sistema per usurpare la rete di comunicazione intercellulare basata sul trasporto esosomiale per favorire la sua diffusione. Il secondo obiettivo di questo lavoro è stato l’analisi degli effetti degli esosomi rilasciati da cellule infette nel riattivare i serbatoi dell’infezione. La latenza virale è il principale ostacolo verso l'eradicazione di numerose malattie infettive. Infatti, l'infezione da HIV-1 pur essendo efficacemente contrastata dalla terapia anti-retrovirale che, ritarda la progressione della malattia, non eradica l'infezione che persiste in forma latente. I serbatoi dell’infezione si generano quando il virus infetta i linfociti T CD4+ attivati che tornano in uno stato di quiescenza. Per questo motivo, si può assumere che il serbatoio dell’HIV-1 è composto prevalentemente linfociti T CD4+ della memoria. Nel dettaglio, nell’ultimo lavoro descritto, abbiamo investigato se gli esosomi prodotti da cellule infette da virus competenti per la replicazione o difettivi possano riattivare i linfociti T CD4+ latentemente infetti. I risultati ottenuti hanno dimostrato che l’HIV-1 che latentemente infetta i linfociti T CD4+ può essere attivato dal TNFα rilasciato in seguito all’ingestione di esosomi prodotti da cellule infette vicine, e che questo fenomeno dipende principalmente dall'attività della metalloproteasi ADAM17 associata agli esosomi. Questi dati rivelano un nuovo meccanismo di riattivazione dell'HIV-1 in serbatoi latenti dell’infezione, rilevante per la progettazione di nuovi interventi terapeutici per l’eradicazione del virus.