The role of Neuroglobin in hematopoietic system

Abstract

Hemoglobin and Myoglobin are proteins that belong to the globins family and are able to deliver and conserve oxygen. In the 2000 a new component of this family has been identified and named Neuroglobin (Ngb). Ngb is mainly expressed in the nervous system, from which it takes its name, but it is located also in the gastrointestinal tract, in the endocrine tissue and in the retina. Ngb is a monometric protein formed by 151 aminoacids (17 KDa) and has a high affinity for oxygen. The human Ngb gene is located in the chromosome 14q24. Over the evolution, the Ngb gene has been conserved and this suggests its relevant role in biological systems. Ngb, as all the globins family’s members, is an heme protein that shows the heme prostetic group, by which can reversibly bind oxygen and other ligands. The iron atom in the prostetic group can have the oxidative state +2 (ferrous) or +3 (ferric). Both in the ferrous and in the ferric state the Ngb is hexacoordinated with other endogenous ligands (proximal and distal hystidine) and O2 or CO crowd-out the distal hystidine to link themselves to the protein. Even though many studies have been conducted, it is not completely clear which functions the Ngb has. It is known that the Ngb plays a protective role in neurons under conditions of hypoxia and hyschemia. Moreover it plays, too, a protective function during the oxidative stress and lipidic peroxidation. However the mechanism by which Ngb can protect neurons has not been completely elucidated yet. Several studies have shown which mechanisms this function can be linked to: 1) the Ngb ability to scavenge reactive oxygen and nitrogen species; 2) its high affinity for oxygen that allows the organism to have a bulk of oxygen during hypoxia conditions; 3) its role in the signal transduction. In fact, the body of literature suggests that Ngb, in its ferrous state and linking oxygen, is quickly converted in the ferric state and only the latter is able to bind the Gα subunit of the G protein, that in turn is bound to the GDP. The link between the Ngb in the ferric state and the G protein does not allow the release of the GDP and consequently the activation of the G protein itself. This way Ngb halts the signal transduction that leads to cell death and guarantees the survival of the cells. Additionally, in the ferric state Ngb can bind Flotillin-1, a protein mainly express in rafts, small membrane domains, rich in sfingolipids e cholesterol, that function as platforms to concentrate and segregate signal molecules during cellular processes. Thus in rafts there are several proteins involved in the signal transduction, among which G proteins. Flotillin is an integral membrane protein that plays a key role in assembling rafts and in the signal transduction. Two different isiform of Flotillin are known: Flotillin-1 and Flotillin-2. The Flotillin-1 gene is localized in the chromosome 6 and code for a 46 KDa protein, particularly expressed in neurons, but also present in the fagosomes membrane, in endosomes and in the nucleus. The function of Flotillin is associated with its localization in rafts and it is involved in many cellular processes: it participates in the glucose income in insulin-stimulated cells; it induces the neuronal regeneration; it participates in the fagosome maturation; it drives the proliferation of prostatic cancer cells and finally it defines an endocytic Clatrin-dependent pathway. According to this information, the aim of the project is to evaluate either the possible expression of Ngb in myeloid cells, and to analyze its function in this specific cell system, and to find a functional relationship between Ngb and Flotillin-1. In this project, a significant expression of Ngb has been individuated in myeloid cells (THP1, U937 and HL60) and in lung cancer cells (H1299, H1650 and H1975). According to these findings, the expression of Ngb during the myeloid differentiation has been analyzed. The expression of Ngb, as well as of Flotillin, increases during the differentiation. Additionally, Ngb is mainly expressed in macrophagic cells. Because of the neuroprotective role of Ngb during the oxidative stress, its expression has been evaluated during a specific condition of stress that occurs in myeloid cells, that is the fagocytosis. The Ngb level improves during the fagocytic process, as well as Flotillin-1, and increases even more during the fagocytosis realized by mature macrophages, which have a basic role in this process. These results suggest a possible involvement of these two proteins in this mechanism. Moreover, the Ngb expression has been analyzed in specific conditions that could have induced cellular stress and apoptosis, particularly during serum deprivation (by testing concentrations of serum lower than the concentration used in standard conditions) and after treatment with hydroxyurea (a DNA synthesis inhibitor). In both these situations there was not a modification in the Ngb expression, suggesting that probably the protein is not involved. Conversely, a remarkable increase of the Ngb expression in myeloid cells has been observed after H2O2 treatment, inducing oxidative stress. This result could suggest that, during oxidative stress conditions, Ngb may play a protective role in myeloid cells as well as shown in neurons. Different drugs can induce oxidative stress, such as Isoniazid (Inh), a first line anti-tubercolar drug. Inh is able to reversibly bind both the ferric and ferrous iron of the heme group in the truncated hemoglobin of the Mycobacterium Tuberculosis. This link modify the heme group properties, making the hemoglobin unable to perform its normal functions. The Ngb, too, has an heme group whose ferrous iron is converted in ferric iron under oxidative stress conditions to protect neurons. Thus, the Ngb expression has been evaluated after treatment with different concentrations of Inh in this cellular system and consequently a dose-dependent increase of Ngb expression has been observed. Afterwards, combining the myeloid differentiation with oxidative stress conditions (H2O2-induced), a higher Ngb level has been measured in mature myeloid cells compared to the Ngb expression in undifferentiated cells. Finally the functional relationship between Ngb and Flotillin-1 in the hematopoietic system has been studied. First of all the possible influence of Flotilin-1 on Ngb has been evaluated. According to this purpose, over-expressing Flotillin-1 cells and Flotillin-1 knockdown cells have been generated. In the first condition no variations in the expression of Ngb have been observed, in the latter a remarkable decrease in the protein have been noticed. The lack of Flotillin-1 prevent Ngb from increasing also in H2O2-induced oxidative stress conditions. This data suggests a possible protective and stabilizing function of Flotillin-1 on Ngb. To confirm this hypothesis, the physical interaction between these two proteins has been investigated by setting up a co-immunoprecipitation assay with an antibody anti-Flotillin-1, and then a Western Blotting with an antibody anti-Ngb, in myeloid cells both in basal conditions and after an H2O2-induced oxidative stress treatment. The results obtained showed that, in myeloid cells, the physical interaction occurs only after H2O2 treatment, thus in conditions of oxidative stress. In conclusions, to sum the data collected during this project: Ngb is expressed in myeloid cells and in lung cancer cells, too; its expression increases during the myeloid differentiation, the fagocytosis and the oxidative stress; additionally, its level tends to diminish in Flotillin-1 knockdown cells; and finally, Ngb interacts with Flotillin-1 during the oxidative stress. According to these results, further studies could be conducted to elucidate and better understand the functions of Ngb in different cellular systems. As examples, the role of Ngb could be analyzed in myeloid progenitors treated with growth factors and induced to differentiate in granulocytes or monocytes. Moreover, as a support to the hypothesis that Ngb has a potential protective effect in myeloid cells under oxidative stress conditions, consequences of the silencing or over-expression of Ngb could be evaluated.

Emoglobina e Mioglobina sono due proteine appartenenti alla famiglia delle globine in grado di trasportare e conservare l’ossigeno. Nel 2000 è stato identificato un terzo membro di questa famiglia: la Neuroglobina (Ngb), particolarmente espressa nel sistema nervoso, (da cui il nome) ma non solo, infatti la si ritrova anche nel tratto gastrointestinale, nel tessuto endocrino e nella retina. Si tratta di una proteina monometrica costituita da 151 amminoacidi (17 KDa) con un’alta affinità per l’ossigeno. Il gene della Ngb umana è situato sul cromosoma 14q24. Nel corso dell’evoluzione il gene della Ngb non ha subito molti cambiamenti e ciò ne sottolinea un ruolo rilevante. La Ngb, come tutti i membri della famiglia delle globine, è una emo proteina, con un gruppo prostetico eme, grazie al quale è in grado di legare reversibilmente l’ossigeno ed altri ligandi. L’atomo di ferro del gruppo prostetico può trovarsi nello stato ferroso (Fe2+) o ferrico (Fe3+). Sia nella forma ferrica che ferrosa la Ngb è esacoordinata con ligandi endogeni (istidina prossimale e distale) e O2 o CO spiazzano l’istidina distale per legarsi essi stessi. Nonostante i numerosi studi effettuati, non si conoscono ancora perfettamente quali siano tutte le funzioni della Ngb. Sicuramente è chiaro che la Ngb svolge una funzione protettiva nei neuroni in condizioni di ipossia ed ischemia. Inoltre la Ngb svolge un’azione protettiva in condizioni di stress ossidativo e perossidazione lipidica. Però il meccanismo completo con cui riesce a svolgere questa sua funzione neuroprotettiva non è stato ancora bene delucidato. Diversi studi hanno sottolineato come questa funzione possa essere collegata: 1-alla capacità della Ngb di eliminare tutte le specie reattive dell’ossigeno e dell’azoto; 2-alla sua elevata affnità per l’ossigeno che garantisce una riserva d’ossigeno utile in condizioni di ipossia; 3-alla sua capacità di intervenire nel meccanismo di trasduzione del segnale. Infatti la letteratura suggerisce che la Ngb nella forma ferrosa (legante l’O2) viene subito convertita nella forma ferrica e solo quest’ultima è in grado di legare la subunità Gα della proteina G legata a sua volta al GDP e ne impedisce il rilascio di quest’ultimo, inibendone quindi l’attivazione. In questo modo la Ngb impedisce l’attivazione della trasduzione del segnale che porta poi alla morte cellulare, garantendo di conseguenza la sopravvivenza cellulare. E’ noto che solo nella forma ferrica la Ngb può legare (oltre a Gα) la Flotillina-1, una proteina particolarmente espressa nei rafts, piccoli domini di membrana, ricchi in sfingolipidi e colesterolo che funzionano da piattaforme per concentrare e segregare molecole segnale in modo da compartimentalizzare i processi cellulari. Nei rafts sono quindi presenti diverse proteine coinvolte nella trasduzione del segnale, tra cui le proteine G. La Flotillina è una proteina integrale di membrana che svolge un ruolo chiave nell’assemblaggio dei rafts e nella trasduzione del segnale. Se ne conoscono due isoforme: Flotillina-1 e -2. Il gene della Flotillina-1 è localizzato sul cromosoma 6 e codifica per una proteina di 47 KDa, particolarmente espressa nei neuroni, ma anche nella membrana dei fagosomi, degli endosomi e nel nucleo. La funzione della Flotillina è associata alla sua localizzazione nei rafts ed è coinvolta in molti processi cellulari: partecipa all’ingresso del glucosio nelle cellule stimolate con insulina, induce la rigenerazione dei neuroni, partecipa alla maturazione dei fagosomi, stimola la proliferazione di cellule cancerose di prostata e definisce un pathway endocitico Clatrina-indipendente. In base a tutte queste informazioni lo scopo di questo lavoro è quello di andare a valutare innanzitutto se la Ngb sia espressa nelle cellule mieloidi e poi eventualmente capire quali siano le sue funzioni in questo sistema e se esista anche qui una relazione funzionale tra Ngb e Flotillina-1. E’ stata individuata un’ampia espressione della Ngb nelle cellule mieloidi utilizzate (THP1, U937 e HL60) ed anche in linee cellulari derivanti dal cancro ai polmoni (H1299, H1650 e H1975). Sulla base di questo rsultato siamo andati poi a valutare l’espressione della Ngb durante il differenziamento mieloide. Abbiamo riscontrato che l’espressione della Ngb, così come quella della Flotillina, aumenta durante questo processo ed in particolare la Ngb è espressa a più alti livelli in cellule macrofagiche. Visto che nei neuroni la Ngb ha una funzione protettiva nei confronti dello stress ossidativo, siamo andati a studiare l’espressione della Ngb durante una condizione di stress ossidativo che si verifica nelle cellule mieloidi, vale a dire durante la fagocitosi. Abbiamo osservato che l’espressione della Ngb aumenta nel corso di questo processo, così come la Flotillina-1, ed aumenta ancora di più durante la fagocitosi a carico di macrofagi maturi, che hanno un ruolo fondamentale nel processo stesso. Questi risultati suggeriscono un possibile coinvolgimento di queste due proteine in questo processo. Siamo andati poi a studiare l’espressione della Ngb in cellule mieloidi in condizioni che potrebbero indurre stress cellulare o apoptosi: durante la deprivazione di siero (testando diverse concentrazioni di siero al di sotto di quella utilizzata in condizioni standard) ed in seguito a trattamento con idrossiurea (un inibitore della sintesi di DNA). In entrambe le situazioni non abbiamo riscontrato nessuna varazione nei livelli di espressione della Ngb, suggerendo probabilmente un mancato coinvolgimento della Ngb stessa. Mentre abbiamo registrato un considerevole aumento di espressione della Ngb in seguito a trattamento delle cellule mieloidi con H2O2 per indurre stress ossidativo. Questo risultato ci consente di ipotizzare che durante condizioni di stress ossidativo la Ngb, oltre ad una funzione neuroprotettiva, svolge la stessa funzione di protezione anche nelle cellule mieloidi. Diversi farmaci sono in grado di indurre stress ossidativo, uno di questi è l’isoniazide (Inh), farmaco anti tubercolare di prima linea. Inh inoltre è in grado di legare reversibilmente il Fe in forma ferrica e ferrosa del gruppo eme dell’emoglobina troncata del Mycobacterium tuberculosis, legame che perturba le proprietà del gruppo eme, renendo l’emoglobina incapace di svolgere le sue normali funzioni. Dato che anche la Ngb ha un gruppo eme, che viene convertito nella forma ferrica in condizioni di stress ossidativo per poter espletare la sua funzione neuroprotettiva, siamo andati a valutare l’espressione della Ngb in seguito a trattamento delle cellule mieloidi con varie concentrazioni di Inh. Abbiamo riscontrato un aumento di espressione della Ngb all’aumentare delle dosi di Inh somministrata. Avendo osservato che l’espressione della Ngb aumenta durante il differenziamento mieloide ed in condizioni di stress ossidativo, abbiamo pensato di combinare i due processi e vedere cosa accadesse alla Ngb. Abbiamo così osservato che l’espressione della Ngb aumenta ancora di più nel caso di stress ossidativo indotto in cellule mieloidi dfferenziate. In fine siamo andati a studiare la relazione tra Ngb e Flotillina-1 nel sistema ematopoietico. Prima di tutto siamo anadati a valutare se l’espressione della Flotillina-1 influenza quella della Ngb. Pertanto abbiamo prodotto cellule mieloidi sovra-esprimenti la Flotillina-1 e cellule in cui la Flotillina-1 è stata sileziata. Nel primo caso non abbiamo riscontrato nessuna variazione di espressione della Ngb, mentre abbiamo osservato una notevole diminuizione di espressione della Ngb nelle cellule in cui la Flotillina-1 era stata silenziata. L’assenza della Flotillina-1 impedisce l’aumento di espressione della Ngb anche nel caso di trattamento con H2O2 per indurre stress ossidativo. Questi risultati suggeriscono una possibile funzione protettiva e di stabilizzazione da parte della Flotillina-1 sulla Ngb. Per confermare questa ipotesi siamo andati a studiare se esiste un’interazione tra queste due proteine. Pertanto abbiamo messo a punto un esperimento di co-immunoprecipitazione utilizzando un anticorpo anti-Flotillina-1, seguito da Western Blotting con un anticorpo anti-Ngb. Questo è stato fatto in cellule mieloidi sia in condizioni basali che in seguito a trattamento con H2O2 per indurre stress ossidativo. Abbiamo ottenuto un risultato positivo, ossia un interazione, solo dopo trattamento con H2O2. Quindi in cellule mieloidi la Ngb interagisce fisicamente con la Flotillina-1 solo in condizioni di stress ossidativo. In conclusione possiamo affermare che la Ngb è espressa in cellule mieloidi e di cancro al polmone; la sua espressione aumenta durante: il differenziamento mieloide, la fagocitosi e lo stress ossidativo; la sua espressione diminuisce in cellule in cui la Flotillina è stata silenziata; interagisce con la Flotillina-1 durante lo stress ossidativo. In base ai risultati ottenuti sarebbe interessante andare a studiare il ruolo della Ngb nei progenitori ematopoietici sottoposti a fattori di crescita e di differenziamento verso la linea granulocitaria o monocitaria. Inoltre per rafforzare i dati che sostengono un potenziale ruolo protettivo della Ngb in condizioni di stress ossidativo in cellule mieloidi, andrebbe valutato l’effetto conseguente alla sua sovra-espressione e al suo silenziamento.