Differentation and modulation of innate immunity response in human cord blood cells

Abstract

Lo sviluppo delle barriere difensive si è rivelato un evento essenziale per l’evoluzione, in quanto ha consentito di separare l’ambiente esterno dal sempre più complesso ambiente interno. Siamo costantemente esposti ad agenti infettivi e tuttavia, nella maggior parte dei casi, siamo in grado di contrastarli, grazie al nostro sistema immunitario che agisce mediante due tipi di risposta: - la risposta non specifica o innata, che costituisce la prima linea di difesa ed opera in modo non selettivo verso antigeni estranei; - la risposta specifica o adattativa, diretta verso antigeni specifici. Il tipo di risposta è dettato dalla natura dell’antigene. Una risposta immunitaria completa richiede la partecipazione coordinata di entrambe. La risposta immunitaria innata è mediata da proteine recettoriali appartenenti alla classe dei “pattern recognition receptors” (PPR) (1), che riconoscono motivi strutturali conservati presenti sugli antigeni, come componenti espresse esclusivamente da microorganismi, definite “pathogen associated molecular patterns” (PAMPs) (2), o molecole rilasciate in seguito ad un danno cellulare definite “damage-associated molecular patterns” (DAMPs) (3). In particolare, un tipo di PPR sono i “toll-like receptors” (TLR), una famiglia di proteine transmembrana espresse soprattutto sulla superficie delle cellule immunocompetenti, ossia monociti, macrofagi e cellule dendritiche, ma anche sulla superficie delle cellule epiteliali. L’espressione dei TLRs ha assunto un’importanza considerevole per la salute neonatale con la recente dimostrazione che i TLRs partecipano al riconoscimento di patogeni rilevanti per il neonato, tra cui Streptococco di gruppo B, Listeria monocytogenes, Mycoplasma hominis, Candida. albicans e Citomegalovirus riconosciuti dal TLR-2 o Enterobacteriaceae, C. albicans e il Virus Respiratorio Sinciziale dal TLR-4. Anche se l'espressione basale dei TLRs sui monociti del sangue del neonato è simile a quella degli adulti, le conseguenze funzionali della loro attivazione sono molto diverse con implicazioni in una vasta gamma di malattie, quali infezioni, immunodeficienza, sepsi, malattie autoimmuni e allergie (4). Il sistema immunitario neonatale è generalmente considerato immaturo e meno funzionale rispetto alla controparte adulta e funzionalmente carente nel contrastare l’attacco di patogeni, aumentando nel neonato la suscettibilità a contrarre infezioni con conseguente incremento della mortalità (5). L’immaturità del sistema immunitario neonatale deriva da effetti combinati di una serie di fattori quali l’immaturità dei suoi componenti cellulari, la mancanza di esposizione agli antigeni, l’esposizione intrauterina ad unico ambiente, che può favorire uno sviluppo di una risposta linfocitaria di tipo Th2, la bassa capacità di proliferazione dei linfociti T e l’alterata produzione di citochine Th1. La proteina “High mobility group box 1” (HMGB1) è una molecola DAMP che lega il TLR-4 e il recettore RAGE (“receptor for advanced glycation end-products”). In principio HMGB1 è stato studiato come co-fattore nucleare coinvolto nella regolazione della trascrizione genica, ma successivamente è stato dimostrato che HMGB1 viene anche rilasciato attivamente o passivamente dalle cellule per poi agire come un citochina pro-infiammatoria (6). Molti studi dimostrano come HMGB1 sia implicato nella patogenesi di diverse patologie, quali artrite, cancro, epatite, malaria, ischemia del miocardio, sepsi. Obbiettivi della ricerca L’obbiettivo principale del lavoro è stato quello di comprendere meglio i meccanismi che sono alla base delle risposte dell’immunità innata nel neonato e nella prima infanzia per aprire la strada a possibili approcci di immunomodulazione a scopo terapeutico. In considerazione dell’importanza dei recettori TLRs nella risposta innata e della loro anomala attivazione in associazione ad alcune malattie a base allergica, è stata valutata l’associazione tra polimorfismi a singolo nucleotide (SNP) nel TRL-2 o TRL-4 e allergie atopiche in una coorte di bambini italiani allergici. Un’altra parte dello studio è stata invece rivolta all’analisi dell’espressione di HMGB1 nel sangue del cordone ombelicale. L'espressione di HMGB1 e il suo ruolo nella risposta immunitaria sono stati studiati quasi esclusivamente nel sangue periferico (PB) di individui adulti e solo recentemente, è stato osservato che HMGB1, insieme con il recettore solubile (sRAGE), possono essere importanti mediatori del danno cellulare nel feto e fattore cruciale nella nascita pre-termine (7). Data l’importanza di comprendere il profilo immunitario immaturo del neonato, è stata comparata l’espressione di HMGB1 nelle cellule isolate dal sangue di cordone ombelicale (CB) rispetto al PB caratterizzando sia l'espressione di HMGB1 e la sua distribuzione nelle diverse popolazioni presenti nel sangue che valutando la sua possibile modulazione ad opera di diversi stimoli in termini di presenza nella cellula e secrezione extracellulare. Risultati Per studiare una possibile associazione tra polimorfismi del TLR ed allergie in pazienti in età pediatrica, SNPs R753Q nel TLR-2 o D299G nel TLR-4 sono stati individuati mediante PCR Real- Time da DNA isolato da sangue periferico. Nel gruppo di controllo, composto da 147 individui sani, il polimorfismo R753Q aveva una prevalenza del 2,5% mentre la frequenza della mutazione D299G del 12%. Nessuno dei 159 pazienti allergici ha mostrato il SNP R753Q. Nel TLR-4, invece, 7/57 pazienti affetti da allergia alimentare (12%) e 6/102 pazienti con eczema (6%) presentavano la mutazione in D299G. I dati mostrano assenza di correlazione tra i polimorfismi studiati nel TLR e allergie atopiche (eczema e allergia alimentare), suggerendo che non costituiscono marcatori per le malattie atopiche nei bambini in Italia. Recentemente, nelle malattie asmatiche, è stato riscontrato un altro fattore che sembrerebbe svolgere un ruolo importante: HMGB1 (8). In considerazione del fatto che HMGB1, come citochina pro-infiammatoria, è stata caratterizzata esclusivamente nel sangue periferico di individui adulti, abbiamo deciso di analizzare l'espressione di HMGB1 in cellule mononucleate isolate dal CB mediante analisi in citofluorimetria (FACS). Come atteso, la totalità delle cellule permeabilizzate del CB o PB esprimevano HMGB1, in quanto HMGB1 è un cofattore nucleare ubiquitario. In assenza di permeabilizzazione, è stato possibile rilevare la presenza di HMGB1 anche sulla superficie delle cellule del CB con una percentuale del 13(±4)% (n=8), che era esattamente paragonabile a quella riscontrata sulle cellule HeLa (una linea stabilizzata da un carcinoma umano della cervice uterina che è noto esprimere HMGB1). Nel PB la proteina era presente nel 6.5(±1.8)% delle cellule (n = 8). È interessante notare che le cellule del CB presentavano un’espressione di HMGB1 più alta rispetto alle cellule del PB e tale differenza era statisticamente significativa (P=0.02). Al fine di caratterizzare l’espressione di HMGB1 sulle differenti popolazioni cellulari presenti nel sangue, è stata effettuata una analisi citofluorimetrica utilizzando più anticorpi contemporaneamente. Nelle cellule del cordone, così come nel periferico, circa il 90% di HMGB1 era espresso su precursori delle cellule dendritiche (DCs) di tipo mieloide identificati mediante l’analisi dell’espressione di due marcatori fenotipici di membrana: CD14 +CD11c+ (monociti) e CD14 -CD11c+ (DCs). Solo una piccola percentuale di linfociti CD3+ esprimeva HMGB1 [11(±8)%]. Al fine di identificare le varie sottopopolazioni linfocitarie HMGB1+ positive, le cellule CD3 + sono state ulteriormente caratterizzate mediante FACS utilizzando anticorpi monoclonali diretti verso il CD4, CD8 e TCR gammadelta (Vδ2). Nel CB e PB, HMGB1 era espresso principalmente sulle cellule T γδ e CD4+ mentre i linfociti CD8+ sono risultati negativi. Questi esperimenti sono stati eseguiti a 48 ore dalla purificazione delle cellule mononucleate da sangue intero. Dopo 14 giorni di coltura, invece, sono state analizzate due differenti popolazioni cellulari: cellule aderenti e cellule in sospensione. Mediante analisi al FACS, è stato osservato che le cellule aderenti del CB esprimevano livelli significativamente più alti di HMGB1 rispetto alle non aderenti [14( ±5)% contro il 7( ± 3)% delle non-aderenti; P = 0,003]. Al contrario, nel PB le due popolazioni cellulari mostravano un livello simile di espressione. Inoltre, cellule aderenti del CB presentavano livelli di espressione di HMGB1 più elevate rispetto alla controparte del PB, in accordo con i risultati ottenuti a 48 ore, indicando che l’espressione di HMGB1 è confinata principalmente a cellule maggiormente differenziate che anche in questo caso sono state identificate al FACS come monociti e DCs. Nel sangue periferico, la proteina HMGB1 si comporta come una citochina rilasciata dalle cellule immunitarie attivate, capace di mediare risposte a infezioni, lesioni e infiammazioni. Abbiamo così indagato se segnali diversi di attivazione, quali stimoli pro-infiammatori (TNF-α, IL-2 o IL-15) o che mimano infezioni, quali il trattamento con lipopolisaccaride batterico (LPS) o l’enterotossina B di Staphylococcus aureus (SEB) o il “Phorbol 12-Myristate 13-Acetate” (PMA), influenzino l'espressione di HMGB1 e la sua secrezione. L’analisi citofluorimetrica ha mostrato che tutti gli stimoli erano in grado di incrementare l'espressione di HMGB1 sulle cellule del CB e PB. Inoltre l'aumenta espressione della proteina sulla membrana cellulare era associata ad un aumento significativo dei livelli di HMGB1 rilasciati nel terreno di coltura, analizzati tramite Western Blot. Per determinare se la modulazione dell'espressione di HMGB1 nelle cellule CB fosse associata a una sua diversa localizzazione intracellulare, cellule trattate con LPS sono state analizzate in microscopia confocale. L’immunofluorescenza ha mostrato che, in cellule del CB non trattate, HMGB1 presentava un’espressione eterogenea, localizzata principalmente nel nucleo e citoplasma. Dopo 48 ore di stimolazione con LPS, l’espressione di HMGB1 appariva principalmente sul perimetro esterno delle cellule, come indicato dalla sua co-localizzazione con la membrana plasmatica. Il coinvolgimento della membrana cellulare nella secrezione di HMGB1, osservato al FACS e in microscopia confocale, è stato ulteriormente confermato studiando l'effetto del gliburide, un inibitore del trasporto proteico di tipo non-classico. I risultati hanno mostrato che il gliburide induceva una riduzione di circa il 50% dell’espressione costitutiva di HMGB1 sulla superficie cellulare sia in CB che in PB. Inoltre, l’inibitore era in grado di bloccare il rilascio della proteina procurato dal trattamento con LPS, ripristinando l'espressione di superficie di HMGB1 che era stata ridotta come conseguenza della sua secrezione. Gli aminobisfosfonati (ABs) (Pamidronato o PAM, e Zoledronato o ZOL), farmaci utilizzati nell’osteoporosi e nella terapia antitumorale, sono potenti attivatori dei linfociti T γδ (9). Dal momento che è stato provato che HMGB1 è espresso sui linfociti T γδ, PAM e ZOL sono stati utilizzati per verificare le loro possibili capacità di modulare l’espressione di HMGB1. E’ stato dimostrato che PAM e ZOL inducevano nelle cellule del CB e PB: i) l’espressione di HMGB1 sulla superficie cellulare; ii) la proliferazione di linfociti T γδ HMGB1+ e iii) la secrezione di HMGB1. Per dimostrare che la secrezione di HMGB1 indotta da ABs non fosse determinata da morte cellulare, a 14 giorni di trattamento sono state valutate sia l'apoptosi che la necrosi mediante l'analisi al FACS. Non è stato osservato alcun cambiamento significativo del numero di cellule annessina V+ e ioduro di propidio positive nel trattamento con ABs rispetto al controllo. Avendo riscontrato che HMGB1 viene rilasciato dalle cellule a seguito di differenti stimoli, terreni pre-condizionati, generati dalla coltura di cellule del CB o PB trattate con IL-2, sono stati utilizzati per valutarne l’effetto sulla migrazione cellulare. E’ stato osservato che i terreni pre-condizionati erano in grado di indurre la migrazione delle cellule monocitiche del CB e PB. Inoltre, la presenza del frammento N-terminale di HMGB1, Box A, antagonista di HMGB1 stesso, o dell’anticorpo neutralizzante anti-RAGE inibivano la migrazione di circa il 50%. Questi risultati dimostrano chiaramente che HMGB1, rilasciato dalle cellule del cordone o del sangue periferico, è funzionalmente attivo e manifesta attività chemiotattica. Conclusioni I TLRs hanno un ruolo fondamentale nella risposta dell’immunità innata neonatale. La perdita della loro corretta funzionalità aumenta la suscettibilità o la predisposizione di un individuo a sviluppare immunodeficienze o malattie autoimmuni. Una migliore comprensione dei meccanismi che sono alla base delle risposte dell’immunità innata neonatale potrebbe portare allo sviluppo di nuove terapie per patologie quali infezioni, cancro e allergie. Agonisti dei TLRs, per esempio, potrebbero rappresentare strumenti idonei per migliorare la difesa dell’individuo nei confronti di agenti patogeni (10) o per ridurre potenziali allergie, modulando risposte immunitarie di tipo Th2 (11). In realtà, diversi studi hanno indicato che alcuni polimorfismi del TLR-4 e TLR-2 sono stati associati ad allergie, quali asma o eczema atopico. In accordo con i recenti dati di letteratura (12), abbiamo dimostrato che, al contrario, alcuni polimorfismi del TLR-2 e TLR-4 non sono associati con eczema e allergie alimentari nei bambini italiani allergici, a indicare che la correlazione tra la malattia e il polimorfismo del TLR potrebbe essere influenzata positivamente o negativamente da fattori diversi quali il corredo genetico di ogni singolo individuo, la natura degli antigeni associati o l’ambiente in cui vive. Recentemente, nel fluido di lavaggio bronco-alveolare di pazienti con malattia polmonare ostruttiva cronica sono stati osservati elevati livelli di HMGB1 che è stato considerato, insieme al suo recettore solubile sRAGE, un nuovo biomarker nell'asma grave (8). Questi dati suggeriscono che HMGB1 potrebbe avere un ruolo nelle malattie asmatiche. Considerando che l'asma e le allergie atopiche sono considerate malattie infiammatorie, inibire il rilascio extracellulare di HMGB1 potrebbe rappresentare un trattamento terapeutico idoneo per il trattamento di queste patologie. E’ anche stata messa in luce l'importanza di HMGB1 come mediatore di infiammazione, nel sistema neonatale oltre che nell’adulto. Infatti, il lavoro svolto nel corso del dottorato ha messo in evidenza, per la prima volta, che cellule mononucleate isolate dal sangue umano del cordone ombelicale esprimono e rilasciano HMGB1. HMGB1 è presente principalmente su una popolazione di cellule differenziate, quali DCs e monociti, e in misura minore su i linfociti T CD4 e γ δ. Questi risultati sono completamente in accordo con il ruolo che HMGB1 ha nella risposta immunitaria innata, che vede macrofagi attivati, monociti, DCs e linfociti T γ δ come principali attori. Inoltre, è stato rilevato che stimoli diversi, quali stimoli pro-infiammatori o antigeni dei linfociti T γ δ, come Pamidronato e Zoledronato, modulano l'espressione di HMGB1 e la sua secrezione secondo la via di secrezione non classica. Questo studio fornisce la prima dimostrazione che gli aminobifosfonati sono in grado di modulare l'espressione di HMGB1 in cellule del CB e del PB, coinvolgendo linfociti T γ δ direttamente o attraverso le cellule APC (antigen presenting cells). HMGB1, rilasciato nell’ambiente extracellulare, può funzionare come citochina ed esprimere capacità chemottatiche verso i monociti. L'identificazione di molecole capaci di inibire l’attività di HMGB1 sta assumendo notevole interesse clinico (13). Alcuni studi hanno dimostrato la fattibilità dello sviluppo di modulatori di HMGB1 per nuove terapie, sistemiche e locali, che hanno come bersaglio patologie infiammatorie. La recente identificazione della funzione inibitrice della glicirrizina ha portato sul mercato italiano alla commercializzazione di uno spray nasale per la terapia della rinite e della poliposi. Inibire il rilascio extracellulare di HMGB1 potrebbe rappresentare una strategia terapeutica idonea per il trattamento dell’infiammazione, mentre indurne il rilascio potrebbe permettere lo sviluppo di una risposta immunitaria cellulo-mediata di tipo Th1 essenziale per un’ottima immunizzazione a seguito di vaccinazione. Per immunoterapia biologica si intende un trattamento basato sull’uso e/o la modulazione di componenti del sistema immunitario per promuovere una risposta immunitaria efficace contro le malattie. E’ stato dimostrato che HMGB1 extracellulare funziona come immunoadiuvante ad esempio aumentando l'immunogenicità di cellule di linfoma oppure ottimizzando la risposta anticorpale alla proteina solubile ovalbumina. Inoltre, Hp91, un corto frammento peptidico della proteina HMGB1, induce attivazione di DCs, aumentando la secrezione di citochine proinfiammatorie di tipo Th1 e di chemochine (14). Pertanto, HMGB1 viene proposto come nuovo adiuvante per vaccini. In questo scenario, gli ABs, che sono in grado di stimolare l'immunità innata, tramite l’attivazione di linfociti γ δ (15) e la secrezione di HMGB1, potrebbero essere presi in considerazione come immuno-modulanti per patologie neonatali. Considerando che ZOL o PAM sono utilizzati nella terapia antitumorale, gli ABs potrebbero interferire nella complessa interazione tra tumore e sistema immunitario dell’ospite tramite il rilascio di mediatori infiammatori, come HMGB1, che mediano la presentazione di antigeni tumorali e l’induzione di una risposta antigene tumorale-specifica dei linfociti T citotossici. La capacità immuno-adiuvante di HMGB1 rende questa proteina un candidato promettente anche nell’immunoterapia dei tumori (16).