The relationship between serotonergic system and polyamines system in epilepsy

Abstract

Polyamines are small ubiquitous molecules that can be found in most living species. They have central roles in protein synthesis, cell division and cell proliferation. Their positive charge makes them capable of interacting with many different molecules of opposite charge within the cells, including nucleic acids, proteins and phospholipids. Several studies have been conducted to investigate the role of polyamines in cancer and other diseases, but their role in brain physiology is still unclear and is currently under active research. Recent data show that polyamine metabolism is affected in several neurodegenerative disorders, including Alzheimer’s disease, Huntington’s disease, Parkinson’s disease, Amyotrophic Lateral Sclerosis, as well as after cerebral trauma and ischemia. In the last decades, the polyamine system has also been involved in the predisposition to mental illness. The main natural polyamines found in mammal cells are putrescine, spermidine and spermine. It is well known that spermine, and in some cases spermidine, can modulate the activity of ionotropic glutamate receptors, regulating the synaptic excitability and plasticity. They are also implicated in pathological conditions, especially in excitotoxic states. Excitotoxicity refers to a process of neuronal death triggered by elevated levels of excitatory amino acids resulting in the opening of ionotropic glutamate receptors causing prolonged depolarization of neurons, the consequent entry of calcium, and the activation of enzymatic and nuclear mechanisms of cell death. Excessive activation of glutamate receptors by excitatory amino acids is indeed the initial step of the excitotoxic pathway that leads to epilepsy. Over the last few years, several epidemiological studies have shown a strong correlation between epilepsy and different mental illnesses; the comorbidity between epilepsy and psychiatric diseases is increasingly recognized. In this regard, the aim of my project was to understand if an alteration in polyamines levels, by specifically overexpressing a catabolic enzyme, could lead to increased excitotoxicity and to a possible concomitant predisposition to mental illnesses. Spermine oxidase is an enzyme of the polyamine catabolic pathway. It catalyses the oxidation of spermine to produce spermidine, 3-aminopropanal and hydrogen peroxide. The research group I joined to carry out my PhD thesis work, has investigated for years the effects of spermine oxidase overexpression, so far unknown, in a genetic mouse model. This mouse line underwent excitotoxic stress after kainic acid injection. Kainic acid mimics glutamate by acting on the excitatory system and provoking epileptic seizures. In order to understand the role of spermine oxidase in excitotoxicity, I focused my attention on the inhibitory system, the GABAergic system. The latter reduces the neuronal electrical activity in the whole nervous system. Through GABA, the main inhibitory neurotransmitter, the maintenance of a low state of spontaneous activation in neurons is ensured, regulating the stability of functioning of the entire nervous system. I bred and used the transgenic mouse line Dach-SMOX that overexpresses spermine oxidase specifically in the neocortex. This mouse was analysed both in physiological and in pathological conditions. Induction of the epileptic phenotype on transgenic and control mice was performed by administration of the epileptogenic drug pentylentetrazole, which is strong inhibitor of the GABA(A) receptors. Behavioural evaluation was the first preliminary analysis performed to assess the effect of pentylenetetrazole on this mouse line. Transgenic mice reported a higher sensitivity to seizures, after pentylentetrazole injection. I then harvested and analysed mouse brain cortex to study the alterations of the excitatory pathway. To analyse possible changes in polyamines content following vehicle solution or pentylentetrazole injection, the concentrations of putrescine, spermidine and spermine levels in the neocortex were measured by HPLC. Results showed that putrescine and spermidine levels were higher in transgenic mice compared to syngenic mice in vehicle- injected animals, while there was a general decrease of spermidine and spermine, in transgenic animals, after pentylentetrazole injection. In order to evaluate any behavioural abnormalities in Dach-SMOX mouse model, I carried out a comprehensive battery of behavioural tests. These tests are specific to assess conditions such as anxiety, depression and memory impairment. I performed the following tests: light dark box, elevated plus maze, sucrose preference, forced swimming, passive avoidance and novel object recognition. The results of the behavioural analysis showed that the Tg mice display an anxious phenotype compared to syngenic mice evidenced by the elevated plus maze and light dark box tests, while they have not shown symptoms of depression or memory impairment. Once established that the Dach-SMOX mouse model presented a behavioural and emotional alteration, I carried out molecular investigations to characterise and analyse the serotonergic system in this murine line. The serotonergic system, in fact, is one of the key systems implicated in the pathophysiology of different psychiatric diseases. For years the serotonergic system has been analysed only for this role, while in the last decades its deregulation has been connected also with the predisposition to epilepsy. I performed the analysis of different serotonin receptors (5-HT1A, 5-HT1B, 5-HT2A, 5-HT2C) and of the serotonin transporter (5-HTT). The analysis of transcript levels was performed by quantitative Real time PCR while the analysis of protein levels was performed by Western Blot. The results showed that Dach-SMOX mice present an alteration of the serotonergic system. In fact, they show a significant decrease, compared to syngenic mice, both in the transcript levels and in the protein levels of all the receptors and of the transporter that were analysed. It is known that the neurotrophic brain factor, BDNF, promotes the development and function of serotonergic neurons and that its alteration may be related to changes in the serotonergic system, with which it shares a mechanism of mutual regulation. BDNF neurotrophin appears to be altered in the presence of chronic oxidative stress, a condition found in Dach-SMOX mice. Transgenic mice, in fact, have an overproduction of hydrogen peroxide due to the over-expression of the SMOX enzyme. I therefore assessed whether this chronic oxidative stress had altered the levels of BDNF and its receptor Trkb. The analyses showed no significant differences between transgenic and syngeneic mice in BDNF and Trkb transcript levels. In order to discover the molecular mechanisms that in the Dach-SMOX model relate the overexpression of SMOX to an alteration of the serotonergic system, I focused my investigations on the pathways involved in tryptophan metabolism. Within the cells two different pathways use tryptophan as a substrate: serotonin and kynurenine pathways. The shift towards the kynurenine pathway leads to a depletion of the tryptophan available for the synthesis of serotonin with consequent alteration of the system itself. Recent literature data have shown how high levels of spermidine are able to activate Src kinase, which in turn activates the IDO1 enzyme. IDO1 catalyses the first step of the kynurenine pathway. I analysed the activation status of Src kinase by western blot, finding a state of greater activation in transgenic mice. The analysis of IDO1 transcript levels also showed that it is significantly higher in Dach-SMOX mice. A higher activation of kynurenine pathway could be the cause of the changes observed in the serotonergic system. In conclusion, with this research project I investigated how the polyamine and serotonergic systems could be correlated. The experimental evidences obtained during the characterization of the Dach-SMOX mouse model show that this genetic system is a promising model to study the comorbidity between mental diseases and epilepsy. The link between the polyamine and serotonin pathways proposed in this project suggests that polyamines can be considered as a new research target for the treatment of mental illnesses.

Le poliammine sono piccole molecole ubiquitarie presenti nella maggior parte delle specie viventi. Grazie alla loro carica positiva, sono in grado di interagire con differenti molecole di opposta carica, compresi acidi nucleici, proteine e fosfolipidi. Diversi studi hanno esaminato il coinvolgimento delle poliammine nel cancro e in altre patologie, ciononostante il loro ruolo nel cervello non è ancora chiaro ed è tutt’ora argomento di ricerca. Dati recenti dimostrano che il metabolismo delle poliammine è alterato in diverse malattie neurodegenerative, come Alzheimer, Huntington, Parkinson, sclerosi laterale amiotrofica ed anche a seguito di trauma e ischemia cerebrale. Negli ultimi decenni è emerso anche un coinvolgimento del sistema delle poliammine nella predisposizione alle malattie mentali. Le principali poliammine presenti nei mammiferi sono putrescina, spermidina e spermina. È noto che la spermina, e in alcuni casi la spermidina, possano direttamente modulare l’attività dei recettori ionotropici del glutammato, regolando l’eccitabilità e la plasticità sinaptica. Sono inoltre implicate in diverse patologie, specialmente in condizioni eccitotossiche. L’eccitotossicità è un processo di morte cellulare causato da elevati livelli di amminoacidi eccitatori, che provocano l’apertura dei recettori ionotropici del glutammato, causando una prolungata depolarizzazione dei neuroni, conseguente entrata di calcio e attivazione di meccanismi di morte cellulare. Una eccessiva attivazione dei recettori del glutammato da parte di amminoacidi eccitatori è senza dubbio lo step iniziale di un pathway eccitatorio che porta all’epilessia. Dati epidemiologici hanno portato alla luce l’esistenza di una forte comorbidità tra epilessia e malattie mentali. A questo proposito, lo scopo del mio studio è stato valutare se un’alterazione nel livello delle poliammine, specificatamente sovra-esprimendo un enzima catabolico, possa condurre ad una aumentata eccitotossicità ed alla eventuale concomitante predisposizione a malattie mentali. La spermina ossidasi è un enzima, coinvolto nel catabolismo delle poliammine. Catalizza l’ossidazione della spermina in spermidina, 3-amino propanale e perossido di idrogeno. Il gruppo di ricerca, in cui ho svolto il mio lavoro di tesi di dottorato, da anni indaga gli effetti della sovra-espressione della spermina ossidasi, fino ad ora sconosciuti, in un modello murino. Questa linea murina ha mostrato stress eccitotossico dopo iniezione con acido kainico. L’acido kainico mima l’azione del glutammato sul sistema eccitatorio e provoca crisi epilettiche. Al fine di comprendere il ruolo della spermina ossidasi nell’eccitotossicità, ho concentrato la mia attenzione sul sistema inibitorio, il sistema GABAergico. Quest’ultimo esercita un’azione di sedazione sull’attività elettrica neuronale in tutto il sistema nervoso. Attraverso il GABA, principale neurotrasmettitore inibitorio, assicura il mantenimento di un basso stato di attivazione spontanea nei neuroni, regolando la stabilità di funzionamento dell’intero sistema nervoso. Per i miei studi, ho allevato, genotipizzato e impiegato la linea transgenica murina Dach-SMOX, che sovra-esprime la spermina ossidasi nella neocorteccia. Questa linea murina è stata analizzata sia in condizioni fisiologiche s patologiche. L’induzione del fenotipo epilettico in topi transgenici e di controllo, è stato ottenuto tramite somministrazione del farmaco epilettogeno pentilentetrazolo. La valutazione del comportamento è stato il primo passo di un’analisi preliminare per stabilire l’effetto del farmaco epilettogeno su questa linea murina. I topi transgenici hanno riportato, in seguito ad iniezione, una maggiore sensibilità a crisi epilettiche. Le cortecce cerebrali sono state poi campionate ed analizzate. Per esaminare i possibili cambiamenti nei livelli delle poliammine, ho misurato i livelli di putrescina, spermidina e spermina tramite HPLC, dopo trattamento con soluzione fisiologica o pentilentetrazolo. I risultati hanno mostrato elevati livelli di putrescina e spermidina nei topi transgenici rispetto ai singenici, dopo trattamento con soluzione fisiologica, mentre dopo trattamento con pentilentetrazolo, si è osservato un decremento generale di spermidina e spermina. Per determinare eventuali alterazioni comportamentali della linea murina, ho effettuato test specifici per evidenziare la presenza di patologie mentali quali depressione ed ansia nonché alterazioni a livello di apprendimento e memoria. Ho effettuato i seguenti test: light dark box, elevated plus maze, sucrose preference, forced swimming, passive avoidance e novel object recognition. I risultati delle analisi hanno mostrato che i topi Dach-SMOX hanno un fenotipo ansioso rispetto ai controlli, mentre non hanno presentato alterazioni nei test per la depressione e per la memoria. Una volta appurato che il modello murino Dach-SMOX presentasse un’alterazione dal punto di vista comportamentale, ho effettuato indagini molecolari per caratterizzare ed analizzare il sistema serotoninergico in questa linea murina. Il sistema serotoninergico, infatti, è uno dei sistemi chiave implicato nella fisiopatologia di differenti malattie psichiatriche. Se per anni esso è stato analizzato solo per questo suo ruolo, negli ultimi decenni una sua deregolazione è stata connessa anche con la predisposizione all’epilessia. Ho eseguito l’analisi dei livelli di trascritto tramite quantitative Real time PCR, e dei livelli proteici tramite Western Blot di differenti recettori della serotonina (5-HT1A, 5-HT1B, 5-HT2A, 5-HT2C) e del trasportatore della serotonina (5-HTT). Le analisi dei risultati hanno evidenziato che i topi Dach-SMOX presentano un’alterazione del sistema serotoninergico. Essi infatti mostrano un significativo decremento, rispetto ai singenici, sia nei livelli di trascritto sia nei livelli proteici di tutti i recettori analizzati e anche del trasportatore. È noto che il fattore neurotrofico cerebrale, BDNF, promuova lo sviluppo e la funzione dei neuroni serotoninergici e che una sua alterazione possa essere correlata a cambiamenti del sistema serotoninergico, con il quale condivide un meccanismo di mutuale regolazione. La neurotrofina BDNF sembra essere alterata in presenza di stress ossidativo cronico, condizione riscontrabile nel topo Dach-SMOX. Quest’ultimo, a causa della sovra espressione dell’enzima SMOX, ha una sovra produzione di perossido d’idrogeno; ho valutato pertanto se questo stress ossidativo cronico avesse alterato i livelli di BDNF e del suo recettore Trkb. Le analisi non hanno mostrato differenze significative tra i topi transgenici e singenici nei livelli di trascritto di BDNF e Trkb. Al fine di comprendere quali fossero i meccanismi molecolari che nel modello Dach-SMOX mettono in relazione la sovra espressione di SMOX ad un’alterazione del sistema serotoninergico, ho focalizzato le mie indagini sui pathway coinvolti nel metabolismo del triptofano. Il triptofano all’interno della cellula oltre che per la sintesi proteica viene utilizzato come substrato per due differenti pathway, quello della serotonina e quello della chinurenina. Lo sbilanciamento a favore del pathway della chinurenina determina una deplezione del triptofano disponibile per la sintesi di serotonina con conseguente alterazione del sistema stesso. Recenti dati di letteratura hanno dimostrato come alti livelli di spermidina siano in grado di attivare la Src chinasi, la quale a sua volta attiva l’enzima IDO1 che catalizza il primo step del pathway della chinurenina. Ho analizzato tramite western blot lo stato di attivazione della Src chinasi riscontrandone uno stato di attivazione maggiore nei topi transgenici. L’analisi dei livelli di trascritto di IDO1 ha altresì evidenziato che esso sia significativamente più alto nei topi Dach-SMOX. Lo sbilanciamento del metabolismo del triptofano a favore del pathway della chinurenina potrebbe essere la causa dei cambiamenti osservati nel sistema serotoninergico. In conclusione, tramite questo progetto di ricerca ho investigato come il sistema delle poliammine e quello serotoninergico potessero essere correlati. Le evidenze sperimentali ottenute durante la caratterizzazione del modello murino Dach-SMOX mostrano come questo sistema genetico sia promettente come modello per studiare la comorbidità tra malattie mentali ed epilessia. Il link tra i pathway delle poliammine e della serotonina proposto in questo progetto suggerisce che le poliammine possano essere considerate come un nuovo target di ricerca per il trattamento delle malattie mentali.