STUDY OF THE ROLE OF SPERMINE OXIDASE IN EPILEPSY

Abstract

Polyamines are small ubiquitous molecules that can be found in most living species. They have central roles in protein synthesis, cell division and cell proliferation. Their positive charge makes them capable of interacting with many different molecules within the cells, including nucleic acids, proteins and phospholipids. Several studies have been conducted to investigate the role of polyamines in cancer and other diseases, but their role in brain physiology is still unclear and is currently under active research. Recent data show that polyamine metabolism is affected in several neurodegenerative disorders, including Alzheimer’s disease, Huntington’s disease, Parkinson’s disease, Amyotrophic Lateral Sclerosis, and even after cerebral trauma and ischemia. The main natural polyamines found in mammal cells are putrescine, spermidine and spermine. It is well known that spermine, and in some cases spermidine, can modulate the activity of ionotropic glutamate receptors, regulating the synaptic excitability and plasticity. They are also implicated in pathological conditions, especially in excitotoxic states. Excitotoxicity refers to a process of neuronal death triggered by elevated levels of excitatory amino acids resulting in the opening of ionotropic glutamate receptors causing prolonged depolarization of neurons, the consequent entry of calcium, and the activation of enzymatic and nuclear mechanisms of cell death. Excessive activation of glutamate receptors by excitatory amino acids is indeed the initial step of the excitotoxic pathway that leads to epilepsy. In this regard, my aim was to understand if an alteration in polyamines levels, by specifically overexpressing a catabolic enzyme, could alter synaptic regulation. Spermine oxidase is an enzyme of the polyamine catabolic pathway. It catalyzes the oxidation of spermine to produce spermidine, 3-aminopropanal and hydrogen peroxide. The research group where I carried out my work for the PhD thesis, for years investigated the effects of spermine oxidase overexpression, so far unknown, in a genetic mouse model. This mouse line underwent excitotoxic stress after kainic acid injection. Kainic acid mimics glutamate by acting on the excitatory system and provoking epileptic seizures. To understand the role of spermine oxidase in excitotoxicity, I focused my attention on the inhibitory system, instead of the excitatory one. I bred and used the transgenic mouse line Dach-SMOX that overexpresses spermine oxidase specifically in the neocortex. This mouse was analyzed both in physiological and in pathological conditions. Induction of the epileptic phenotype on transgenic and control mice was performed by administration of the epileptic drug pentylentetrazole. Behavioral evaluation was the first preliminary analysis performed to assess the effect of pentylenetetrazole on this mouse line. Transgenic mice reported a higher sensitivity to seizures, after pentylentetrazole injection. I then harvested and analyzed mouse brain cortex to study the alterations of the excitatory pathway. To analyze possible changes in polyamines content following vehicle solution or pentylentetrazole injection, putrescine, spermidine and spermine levels in the neocortex were measured by HPLC. Results showed that putrescine and spermidine levels were higher in transgenic mice compared to syngenic mice in vehicle-injected animals, while there was a general decrease of spermidine and spermine, in transgenic animals, after pentylentetrazole injection. To investigate if Dach-SMOX mouse line presented, at a morphological level, changes due to the higher excitability, I performed immunohistochemical analyses using antibodies against the nuclear marker NeuN, the astrogliosis marker GFAP and the microglial marker Iba1 on frozen sections of the neocortex from transgenic and syngenic mice treated with vehicle solution or pentylentetrazole. Using NeuN antibody, no significant differences were found in the number of neurons between transgenic and syngenic mice treated with either vehicle solution or pentylentetrazole. However, after pentylentetrazole treatment, the neurons appeared smaller if compared to the neurons of the neocortex of animals treated with vehicle solution. Regarding the GFAP analysis, a similar scenario was observed since there was no significant increase of astrogliosis after the pentylentetrazole treatment in all samples analyzed. On the contrary, Iba1 was highly expressed in the neocortex of vehicle-injected transgenic mice compared to syngenic animals, while after pentylentetrazole treatment, no differences were observed. To investigate if Dach-SMOX mouse line presented an increased oxidative damage, I performed an immunohistochemical analysis, both in physiological conditions and after excitotoxic injury, evaluating the amount of 8-Oxo-2'-deoxyguanosine, a biomarker for oxidative stress. A significant increase of labelled cells was visible in transgenic mice treated with the vehicle solution compared to syngenic mice and an even greater increase was evident after the treatment. Several studies showed that system xc- transporter is involved in oxidative stress response in astrocytes. In pathological conditions, such as glioma, this receptor is overexpressed and can cause excitotoxicity. System xc- transporter expression is regulated by the PhD student Dr Alessia Leonetti Tutor Dr Manuela Cervelli transcription factor Nrf2, which was proved to be more active in transgenic mice. Therefore, to verify if XCT, the catalytic subunit of the transporter, was more expressed in Dach-SMOX mouse line, I performed an immunohistochemical analysis. XCT expression was significantly increased in transgenic mice treated with the vehicle solution compared to syngenic mice and a greater increase after pentylentetrazole treatment was evident. Since glutamate efflux is normally compensated by the activity of the astrocytic glutamate transporters EAAT-1 and EAAT-2, to understand if the expression of these transporters was altered in transgenic mice, I performed a western blot analysis on the extracts of brain cortex. Results showed no significant differences in the EAAT-1 and EAAT-2 protein expression levels between Sg and Tg mice, treated with 40 mg/kg of pentylentetrazole or with the vehicle solution. Since persistent oxidative stress in the synaptic cleft can activate several cellular pathways involved in the oxidative stress response, I analyzed the protein kinase c alpha, that might modulate the antioxidant defense mechanism, functioning in a different way according to whether it operates in physiological transmission or in pathology. Protein kinase c was found increased in transgenic mice treated with the vehicle solution, while after pentylentetrazole injection, there was a general reduction of the protein level. To understand if the inhibition of system xc- activity could represent an efficient strategy to overcome the increased susceptibility to excitotoxicity of the transgenic mouse line, I performed a behavioral analysis on mice treated with pentylentetrazole evaluating the possible anti-epileptic activity of sulfasalazine. Pre-treatment with sulfasalazine completely reverted the increased sensitivity to excitotoxicity of Dach-SMOX mouse line. Surprisingly, pre-treatment of singenic mice, worsened their sensitivity. Analyses were then performed on the harvested brain cortex to evaluate changes in EAAT protein levels, after using a higher concentration of pentylentetrazole and after treatment with sulfasalazine. EAAT-2 was significantly increased in transgenic mice treated with 60 mg/kg of pentylentetrazole in respect to singenic mice, but unchanged between singenic and transgenic mice pre-treated. A significant reduction was observed in pre-treated transgenic mice in respect to the ones treated with pentylentetrazole only. Targeting different steps in polyamine pathway, including biosynthesis, degradation and transport, can represent an innovative strategy for therapeutic intervention in pathologies with difficult or severe side effect treatments. So in parallel, I expressed spermine oxidase in E.coli, purified the protein and started the biochemical characterization of the enzyme with the purpose of identifying spermine oxidase inhibitors, to test on the Dach-SMOX mouse model, that could be used as antiepileptic drugs to prevent or cure epilepsy.

Le poliammine sono piccole molecole ubiquitarie presenti nella maggior parte delle specie viventi. Grazie alla loro carica positiva, sono in grado di interagire con differenti molecole compresi acidi nucleici, proteine e fosfolipidi. Diversi studi hanno esaminato il coinvolgimento delle poliammine nel cancro e in altre patologie, ciononostante il loro ruolo nel cervello non è ancora chiaro ed è tutt’ora argomento di ricerca. Dati recenti dimostrano che il metabolismo delle poliammine risulta alterato in diverse malattie neurodegenerative, comprese Alzheimer, Huntington, Parkinson, sclerosi laterale amiotrofica ed anche a seguito di trauma ed ischemia cerebrale. Le principali poliammine presenti nei mammiferi sono putrescina, spermidina e spermina. È noto che la spermina, e in alcuni casi la spermidina, possono direttamente modulare l’attività dei recettori ionotropici del glutammato, regolando l’eccitabilità e la plasticità sinaptica. Sono inoltre implicate in diverse patologie, specialmente in condizioni eccitotossiche. L’eccitotossicità è un processo di morte cellulare causato da elevati livelli di amminoacidi eccitatori, risultando nell’apertura dei recettori ionotropici del glutammato, causando una prolungata depolarizzazione dei neuroni, la conseguente entrata di calcio e l’attivazione di meccanismi di morte cellulare. Una eccessiva attivazione dei recettori del glutammato da parte di amminoacidi eccitatori è senza dubbio lo step iniziale di un pathway eccitatorio che porta all’epilessia. A questo proposito, lo scopo del mio studio è stato valutare se un’alterazione nel livello delle poliammine, specificatamente sovra-esprimendo un enzima catabolico, possa modificare la regolazione sinaptica. La spermina ossidasi è un enzima, coinvolto nel catabolismo delle poliammine. Catalizza l’ossidazione della spermina in spermidina, 3-amino propanale e perossido di idrogeno. Il gruppo di ricerca, in cui ho svolto il mio lavoro di tesi di dottorato, da anni indaga gli effetti della sovra-espressione della spermina ossidasi, fino ad ora sconosciuti, in un modello murino. Questa linea murina ha mostrato stress eccitotossico dopo iniezione con acido kainico. L’acido kainico mima l’azione del glutammato sul sistema eccitatorio e provoca crisi epilettiche. Al fine di comprendere il ruolo della spermina ossidasi nell’eccitotossicità, ho concentrato la mia attenzione sul sistema inibitorio, piuttosto che su quello eccitatorio. Per i miei studi, ho allevato, genotipizzato e impiegato la linea transgenica murina Dach-SMOX, che sovra-esprime la spermina ossidasi nella neocorteccia. Questa linea murina è stata analizzata sia in condizioni fisiologiche che patologiche. L’induzione del fenotipo epilettico in topi transgenici e di controllo, è 5 stata ottenuta tramite somministrazione del farmaco epilettico pentilentetrazolo. La valutazione del comportamento è stato il primo passo di una analisi preliminare per stabilire l’effetto del farmaco epilettico su questa linea murina. I topi transgenici hanno riportato, in seguito ad iniezione, una maggiore sensibilità a crisi epilettiche. Le cortecce cerebrali sono state poi campionate ed analizzate per studiare alterazioni della via eccitotossica. Per esaminare i possibili cambiamenti nei livelli delle poliammine, ho misurato i livelli di putrescina, spermidina e spermina tramite HPLC, dopo trattamento con soluzione fisiologica o pentilentetrazolo. I risultati hanno mostrato elevati livelli di putrescina e spermidina nei topi transgenici rispetto ai singenici, dopo trattamento con soluzione fisiologica, mentre dopo trattamento con pentilentetrazolo, si è osservato un decremento generale di spermidina e spermina. Per determinare modificazioni morfologiche della corteccia cerebrale della linea murina, ho effettuato analisi di immunoistochimica utilizzando anticorpi contro il marcatore neuronale NeuN, il marcatore astrogliale GFAP e il marcatore microgliale Iba-1, in condizioni sia fisiologiche che dopo iniezione con l’epilettico. Usando NeuN, non sono state trovate differenze significative per quanto riguarda il numero dei neuroni tra topi transgenici e singenici, trattati con soluzione fisiologica o pentilentetrazolo. Tuttavia, dopo trattamento con pentilentetrazolo, i neuroni sono apparsi di dimensioni ridotte rispetto ai neuroni trattati con la soluzione fisiologica. Riguardo l’analisi con GFAP, è stato osservato uno scenario simile, dato che non si è avuto un aumento di astrogliosi dopo trattamento con pentilentetrazolo. Al contrario, Iba-1, è stato trovato altamente espresso nella corteccia dei topi transgenici rispetto ai singenici, trattati con soluzione fisiologica, mentre dopo pentilentetrazolo non si sono osservate differenze. Alti livelli di stress ossidativo possono portare a danni critici per la cellula. Per verificare se il topo Dach-SMOX presentasse un incremento del danno ossidativo, ho eseguito un’analisi immunoistochimica, in condizioni sia fisiologiche che dopo danno eccitotossico, misurando i livelli di 8-Oxo-2’-deossiguanosina, un marker biologico di stress ossidativo. Quest’analisi ha confermato che i topi transgenici presentano un aumento dello stress ossidativo in condizioni fisiologiche, e un aumento ancora più evidente dopo trattamento con il farmaco epilettico, rispetto ai topi di controllo. Alcuni studi hanno dimostrato che il sistema xc è un trasportatore coinvolto nella risposta antiossidante astrocitaria. In situazioni patologiche, come il glioma, questo recettore è sovra-espresso e in grado di causare eccitotossicità. L’espressione del sistema xc è direttamente regolata dal fattore di 6 trascrizione Nrf2, dimostrato essere più attivo nella linea transgenica. Al fine di verificare se XCT, la subunità catalitica del trasportatore, fosse più espressa nei topi transgenici, ho eseguito un saggio di immunoistochimica. L’espressione di XCT è stata riscontrata aumentata nei topi transgenici rispetto ad i topi singenici, ed ulteriormente incrementata in condizioni eccitotossiche. Dato che l’efflusso di glutammato è normalmente compensato dall’attività dei trasportatori del glutammato astrocitari EAAT-1 e EAAT-2, ho eseguito una analisi dei loro livelli proteici tramite saggio western blot su cortecce cerebrali. I risultati non hanno mostrato differenze significative dei livelli di proteina dei trasportatori, sia in condizioni fisiologiche sia dopo trattamento con 40 mg/kg di pentilentetrazolo. Il persistente stress ossidativo nello spazio sinaptico è in grado di attivare diverse vie cellulari coinvolte nella risposta antiossidante, e per questo, ho analizzato tramite western blot, la protein chinasi c alpha, che può modulare i meccanismi di difesa antiossidanti, funzionando in modi diversi a seconda se opera a livello della trasmissione fisiologica o patologica. La chinasi è risultata aumentata nei topi transgenici trattati con soluzione fisiologica, mentre dopo trattamento con pentiletetrazolo, è stata osservata una riduzione generale del livello della proteina. Infine, per valutare se l’inibizione del sistema xc- potesse rappresentare una strategia efficace contro l’aumentata sensibilità allo stress eccitotossico dei topi transgenici, ho eseguito una analisi comportamentale su topi trattati con pentilentetrazolo valutando l’attività antiepilettica della sulfasalazina. Il pre-trattamento con sulfasalazina, è stato efficacie nel revertire completamente la aumentata sensibilità all’eccitotossicità del modello Dach-SMOX. Sorprendentemente, nei topi singenici, il pre-trattamento ne ha peggiorato la sensibilità. Ho poi effettuato analisi sulle cortecce, per valutare cambiamenti dei livelli proteici degli EAAT dopo un aumento della concentrazione di pentilentetrazolo (60 mg/kg) e dopo trattamento con sulfasalazina, EAAT-2 è stato trovato significativamente aumentato nei topi transgenici, rispetto ai singenici, trattati con 60 mg/kg di pentilentetrazolo, mentre nei topi singenici e transgenici pre-trattati, non si sono osservate differenze. Una riduzione significativa di EAAT-2 si è vista nei topi transgenici pre trattati, rispetto ai transgenici trattati con il solo pentilentetrazolo. Analizzare diversi passaggi nel pathway delle poliammine, tra cui biosintesi, degradazione e trasporto, può rappresentare una strategia innovativa per un intervento terapeutico su patologie con trattamenti difficili o con gravi effetti collaterali. In parallelo, quindi, ho espresso la spermina ossidasi in E.coli, ho purificato la proteina e iniziato una 7 caratterizzazione biochimica dell’enzima, con lo scopo di identificare inibitori della spermina ossidasi, da testare sul modello Dach-SMOX, che potrebbero essere usati come farmaci antiepilettici per prevenire o curare l’epilessia.