Integrin αVβ3-dependent functions in monocytes and microglia: modulation by thyroid hormones and the environmental pollutant BPA

Abstract

The thyroid hormones (THs) L-thyroxine (T4) and L-triiodothyronine (T3) are essential regulators of development, differentiation, growth and metabolism, both in the developing and the adult organism. The actions of T3 are mediated by its binding to specific receptor proteins that may translocate to the cell nucleus where they regulate gene expression. Non-genomic or extranuclear effects of thyroid hormone, mediated principally by T4, are initiated at the plasma membrane and do not depend primarily on the interaction of the hormone with classical nuclear receptors (TRs). In the last years, the discovery of integrin αVβ3 as a plasma membrane receptor for THs encourages reconsideration of these hormones as a possible modulators of immune activities and cells of the immune system. There are important effects of TH that appear to be relevant to inflammation and start at the integrin αVβ3. Data from our laboratory showed that THs inhibit the migration induced by chemokine in THP-1 monocytes, showing anti-inflammatory properties. All this information prompted us to study the capability of THs to modulate immune activities in the BV-2 microglia, the resident immune cells of the CNS. In these cells, in fact, the effects of THs have been studied mainly as to the nuclear effects, whereas we focused our attention to the extra-nuclear effects of THs possibly mediated by αVβ3. Therefore, the main goal of the three years PhD is to study whether THs and their analogues might be able to modulate responses typical of immune cells also in murine BV-2 microglial cells and the possible role of integrin αVβ3. First we evaluated the expression of the integrin by flow cytometry analysis and by confocal microscopy. Results show that the integrin αVβ3 shows a high expression in murine microglia, higher than in THP-1 leukemic monocytes. We carried out experiments of cell migration by wound healing together with proliferation curves, cytotoxicity assay by MTT and ROS determination by the intracellular fluorescent probe DCFH-DA. TH is known to be able to modulate the actions of growth factors such as EGF, TGF-α and IGF-1. Previous experiments from our laboratory have shown that THs are able to crosstalk with growth factors. In order to characterize BV-2 microglia and their possible response to THs, we carried out experiments of cell proliferation stimulated by a growth factor, IGF-1, since integrin αVβ3 is a co-receptor and its effect has been already studied with and without THs in different cells, L6 myoblasts from rat skeletal muscle and THP-1 human leukemic monocytes. The proliferation curves of BV-2 cells induced by IGF-1 were carried out both in the presence and absence of THs. THs are able to inhibit the proliferation stimulated by IGF-1 and inhibitors of the integrin fully reverted the inhibitory effect of the hormone. Inhibitors of the transduction signaling show that the effect of TH on IGF-1-stimulated proliferation is mediated by the MAPK pathway. Transmigration and wound healing are strongly dependent on cytokines production and reactive oxygen species (ROS), nitric oxide (NO) and derived products. The capability of THs to give rise to ROS was assessed also in microglia by the fluorescent probe DCFH-DA. ROS induced by T4, were blocked by the inhibitors of integrin αVβ3 as reported in THP-1 monocytes. A possible crosstalk of integrin αVβ3 with the plasma membrane NADPH oxidase can be hypothesized, but at present has not been verified. The wound healing was carried out by a scratch assay. Confluent BV-2 monolayer were scraped to form a wound. Cells were stimulated with LPS, T3 and T4 for 24 hours with and without the inhibitors of integrin αVβ3: RGD peptide and tetraiodothyroacetic acid (tetrac) a metabolite of TH and a probe for integrin αVβ3. THs at physiological concentrations were able to prevent the invasion induced by LPS. The inhibition was not reverted by the use of RGD or tetrac, as expected, but in some cases was potentiated. This unusual effect was already observed in THP-1 monocytes. Recently, it was shown that bisphenol A (BPA), a monomer of plastic materials, binds integrin αVβ3 interfering with the actions of THs as a hormone antagonist. We then examined, over a wide concentration range, the effect of BPA exposure in vitro on the THP-1 human cell line. Preliminary results on the migration induced by MCP-1 show that BPA at all concentrations tested was able to mimic the effects of thyroid hormones and inhibit the migration induced by MCP-1, but at present we are not able to confirm that this inhibition is mediated by interaction between BPA and αVβ3 integrin. In conclusion, the results of my thesis show for the first time that BV-2 murine microglial cells give a response to chemoattractants (LPS and IGF-1) evaluated as expression of integrin αVβ3, cell migration and proliferation similar to that found in THP-1 and THs, mainly T4, are able to inhibit it, indicating that THs also in these cells behave as anti-inflammatory agents.

Gli ormoni tiroidei (THs) L-tiroxina (T4) e L-triiodotironina (T3) sono importanti regolatori nei processi di differenziazione, crescita e metabolismo, sia durante lo sviluppo che nell'organismo adulto. Le azioni del T3 sono mediate dal suo legame con specifici recettori che possono traslocare al nucleo dove regolano l'espressione genica. Gli effetti non genomici o extranucleari dell'ormone tiroideo, mediati principalmente da T4, iniziano a livello della membrana plasmatica e non dipendono principalmente dall'interazione dell'ormone con i classici recettori nucleari (TRs). Negli ultimi anni, la scoperta dell'integrina αVβ3 come recettore di membrana per gli ormoni tiroidei incoraggia al riesame di questi ormoni come possibili modulatori delle attività immunitarie e delle cellule del sistema immune. Sono presenti degli effetti importanti dell'ormone tiroideo che sembrano essere rilevanti nell'infiammazione ed iniziano a livello dell'integrina αVβ3. I dati del nostro laboratorio hanno mostrato che gli ormoni tiroidei inibiscono la migrazione indotta da MCP-1 nei monociti THP-1, mostrando proprietà anti-infiammatorie. Queste informazioni ci hanno spinto a studiare la capacità degli ormoni tiroidei di modulare le attività immunitarie nelle cellule della microglia BV-2, le cellule immunitarie nel sistema nervoso centrale. In queste cellule, sono stati studiati principalmente gli effetti degli ormoni tiroidei mediati dai recettori nucleari, mentre noi abbiamo focalizzato la nostra attenzione sugli effetti extranucleari mediati da αVβ3. Pertanto, l'obiettivo principale del mio dottorato in questi 3 anni è stato quello di studiare se gli ormoni tiroidei e i loro analoghi possano modulare alcune delle risposte tipiche delle cellule del sistema immunitario anche nelle cellule murine della microglia BV-2 e il possibile ruolo dell'integrina αVβ3. Prima di tutto abbiamo misurato l'espressione dell'integrina mediante analisi di citometria a flusso e microscopia confocale. I risultati mostrano che l'integrina αVβ3 è molto più espressa nella microglia, rispetto ai monociti. Abbiamo poi condotto esperimenti di migrazione cellulare mediante il saggio del wound healing insieme a curve di proliferazione, test di citotossicità e determinazione delle ROS mediante la sonda fluorescente intracellulare DCFH-DA. È noto che l’ormone tiroideo è in grado di modulare l’azione di fattori di crescita come EGF, TGF-α e IGF-1. Precedenti esperimenti dal nostro laboratorio hanno dimostrato che gli ormoni tiroidei sono in grado di interagire con i fattori di crescita. Al fine di caratterizzare la microglia BV 2 e la loro possibile risposta agli ormoni tiroidei, abbiamo condotto esperimenti di proliferazione cellulare indotti dal fattore di crescita IGF-1, poiché l'integrina αVβ3 è un suo co-recettore e il suo effetto è già stato studiato in precedenza in altre linee cellulari, come i mioblasti L6 da muscolo scheletrico di ratto e i monociti leucemici umani THP-1. Le curve di proliferazione sulle cellule BV-2 stimolate con IGF-1 sono state eseguite sia in presenza che in assenza degli ormoni tiroidei. Gli ormoni tiroidei sono in grado di inibire la proliferazione cellulare indotta da IGF-1, ma questo effetto inibitorio viene completamente annullato in presenza di inibitori dell’integrina. Lo studio della trasduzione del segnale mediante specifici inibitori ha mostrato che l’effetto inibitorio dell’ormone tiroideo sulla proliferazione indotta da IGF-1 e mediato dalla MAPK. La migrazione cellulare e la guarigione delle ferite dipendono fortemente dalla produzione di citochine e dalle specie reattive dell'ossigeno (ROS), dall'ossido nitrico (NO) e dai loro derivati. La capacità dell’ormone tiroideo di generare ROS è stata valutata anche nella microglia mediante l’uso della sonda fluorescente DCFH-DA. La produzione di ROS, indotte da T4, veniva ridotta in presenza di inibitori dell'integrina αVβ3 come abbiamo già riportato nei monociti THP-1. E’ stato ipotizzato un possibile crosstalk tra l’integrina αVβ3 e la NADPH ossidasi associata alla membrana plasmatica, ma ad oggi non è stato ancora confermato. Il processo di guarigione delle ferite è stato studiato mediante il saggio wound healing. E’ stato creato un taglio (scratch) nel monostrato cellulare con un puntale sterile per pipette. Successivamente le cellule BV-2 sono state stimolate con LPS, T3 e T4 per 24 ore con e senza gli inibitori dell'integrina αVβ3: il tripeptide RGD e l’acido tetraiodotiroacetico (tetrac) un metabolita dell’omone tiroideo che funge anche da sonda per l’integrina αVβ3. Gli ormoni tiroidei a concentrazioni fisiologiche sono in grado di ridurre l'invasione indotta da LPS. L’utilizzo degli inibitori come RGD e tetrac non annulla l’effetto dell’ormone, come ci si aspetterebbe, ma al contrario lo potenzia. Questo insolito effetto era già stato osservato anche nei monociti THP-1. Recentemente, è stato osservato che il bisfenolo A (BPA), un monomero presente nelle materie plastiche, lega l'integrina αVβ3 ed agisce come interferente endocrino comportandosi come antagonista dell’ormone tiroideo. Abbiamo quindi esaminato, in un ampio intervallo di concentrazione, l'effetto del BPA in vitro sulla linea cellulare THP-1. I risultati preliminari mostrano che nella migrazione indotta da MCP-1, il BPA a tutte le concentrazioni testate è in grado di imitare gli effetti degli ormoni tiroidei e inibire la migrazione, ma al momento non siamo in grado di confermare se questa inibizione è mediata dalla interazione tra BPA e l’integrina αVβ3. In conclusione, i risultati della mia tesi mostrano per la prima volta che nelle cellule murine della microglia BV-2 l’effetto dei chemioattrattanti (LPS e IGF-1) modula l’espressione dell’integrina αVβ3, la migrazione cellulare e la proliferazione in modo simile a quello che abbiamo già visto nelle THP-1 e gli ormoni tiroidei, principalmente il T4, sono in grado di annullare i loro effetti, comportandosi come agenti anti-infiammatori.