NITROBINDINS : A NEW FAMILY OF ALL-β BARREL HEME PROTEINS

Abstract

In living organisms, all-α-helical globins (e.g., hemoglobin (Hb) and myoglobin (Mb)) play pivotal roles in O2 transport, storage and sensing, as well as in heme-Fe-based catalysis. Most of them display the classical 3/3 globin fold, which is made up by six α-helices facing the heme: the A, B, and E α-helices form one face of the sandwich, the other side being built by the F, G, and H α helices. Recently, the 2/2 subset of the classical 3/3 α-helical fold has been discovered; it is a sort of bundle composed of anti-parallel pairs, the α-helices B/E and G/H sandwiching the heme. In all-α helical globins, the heme is deeply buried in the protein matrix contacting several hydrophobic residues that prevent the oxidation of the metal center. The fifth coordination ligand of the heme-Fe atom is invariantly the side chain of the proximal HisF8 residue. The heme distal ligand is represented by the E7 residue (mostly His and Tyr), which contributes to the modulation of the metal center reactivity and the stability of the heme-bound ligand. Over the last two decades, monomeric all-β-barrel heme-proteins have been reported. They include Rhodnius prolixus nitrophorins (NPs), human α1-microglobulin (Hs-α1-m), Cimex lectularius nitrophorin (Cl-NP), Arabidopsis thaliana nitrobindin (At-Nb), and Homo sapiens THAP4 (Hs-THAP4). Rp-NPs and Hs-α1-m are eight-stranded anti-parallel all β-barrel heme proteins belonging to the lipocalin family. At-Nb and Hs-THAP4 display a ten-stranded anti-parallel all β-barrel fold could be considered as the heme-binding prototypes of the Nb family. Cl-NP displays a mixed α-helical-β-barrel fold, being structurally related to bacterial exonuclease III and to human inositol polyphosphate-5-phosphatase. In Rp-NPs, Hs-α1-m, and Nbs the penta coordinated heme-Fe atom is tethered to the protein by the imidazole ring of the proximal His residue, which is replaced by the Cys side chain in Cl-NP. The heme distal His residue, present in most of all α-helical globins, is absent in NPs, Hs-α1-m, and Nbs thus avoiding heme-Fe hexa coordination and, in turn, causing the loss of the metal center reactivity. Moreover, the high solvent exposure of the heme does not permit the reduction of the heme Fe-atom, which is stable in the ferric form. This allows to selectively bind small neutral and anionic molecules (e.g. NO). The structural organization of the all α-helical globins, which bind the ferrous heme-Fe, and of the all β barrel and mixed α-helical-β-barrel heme-proteins, which bind the ferric heme-Fe, is at the root of their different functions. Here, a bioinformatics investigation based on the amino acid sequences and three dimensional structures of At-Nb and Hs-THAP4 suggests a conservation of the 10-stranded antiparallel -barrel Nb structural domain in all life kingdoms of the evolutionary ladder. In particular, amino acid residues involved in heme recognition and in the protein structural stabilization are highly conserved (identity: > 29%; homology: > 83%). Moreover, molecular models of putative Nbs from different organisms match very well with each other and with the known three-dimensional structures of Nbs. Furthermore, phylogenetic tree reconstruction indicates that NPs and Nbs group in distinct clades. This suggests that the 10-stranded β-barrel Nbs constitute a new ubiquitous heme protein family spanning from bacteria to Homo sapiens. In order to address key questions regarding Nbs structure and gas-dependent structural changes and reactivity, Mycobacterium tuberculosis Nb (Mt-Nb) and Homo sapiens Nb (Hs-Nb) have been ectopically expressed and spectroscopically characterized. The crystal structures of the ligand-free and cyanide-bound Mt-Nb(III) have been solved to near atomic resolution of 1.2 Å and 1.7 Å, respectively. Mt-Nb(III) forms a compact 10-stranded β-barrel coordinating a heme iron. The heme is coordinated by the Nε of His155 and it is held in place by multiple van der Waals interactions with the surrounding protein. The three-dimensional structure of Mt-Nb is closely similar to that of Hs-Nb and At-Nb. Resonance Raman spectroscopy indicates that at pH 7.0 Mt Nb(III) and Hs-Nb(III) are mainly 6-coordinate high spin (6cHS) His-Fe-H2O aquo species, whereas in the ferrous forms are 5-coordinate high spin (5cHS) species. Notably, Mt-Nb(II)-CO and Hs-Nb(II)-CO display a weak Fe-His bond, which is reflected in the unusually fast CO dissociation rate constant. In contrast, the rates of Mt-Nb(II) and Hs-Nb(II) carbonylation are slower than those of globins. Also imidazole (Im) association to and dissociation from Mt-Nb(III)-Im and Hs-Nb(III)- Im were unusually slow processes. The unusually slow kinetics may reflect the role of the heme distal residues (i.e. His85 in Mt-Nb and Thr91 in Hs-Nb) in modulating ligand binding. In contrast, values of the rate constant of peroxynitrite scavenging from Mt-Nb(III) and Hs-Nb(III) are closely similar to those of most globins. The stably ferric form of Nbs suggests they may play a role not only in the chemistry of reactive nitrogen species but also in their sensing. Indeed, Hs-Nb has been described as a domain of the THAP4 nuclear protein, whose function is still unknown. THAP4 consists of an N-terminal modified zinc finger domain, which binds DNA, and a C-terminal Nb domain. As Hs-Nb(III) catalyzes peroxynitrite detoxification and impairs peroxynitrite-mediated nitration of free L-tyrosine, it can be speculated that THAP4 plays a role in reactive nitrogen species chemistry by coupling the Nb-dependent peroxynitrite detoxification with the modulation of genes transcription. To date, experiments are in progress to characterize the physiological interactors of THAP4 in eukaryotic HEK-293 cells. Results obtained will allow to determine whether THAP4, and in particular of the Hs-Nb domain, is involved in the protection against reactive species and in the balancing between cell survival vs apoptosis.

Le emo-proteine sono metallo-proteine in grado di legare sia covalentemente che non covalentemente il gruppo prostetico eme. La funzione dell’eme varia a seconda della proteina a cui è legato o in base all’ambiente fisiologico. Ad esempio, in alcune proteine l’eme funge da trasportatore di elettroni, in altre lega in modo reversibile l’ossigeno o catalizza la degradazione delle specie reattive dell’azoto e dell’ossigeno. Alle emo-proteine appartengono le globine, proteine globulari con una struttura tridimensionale caratterizzate da un insieme di α-eliche. Le globine, come l’emoglobina (Hb) e la mioglobina (Mb), mostrano un caratteristico ripiegamento definito “three-on-three” (3/3) nel quale ci sono tre eliche disposte su entrambi i lati del gruppo prostetico eme (A-B-E e F-G-H) alternate a tratti non elicoidali. Recentemente, un sottogruppo delle globine (3/3) caratterizzato da un ripiegamento “two-on-two” (2/2) è stato identificato nelle piante, negli eucarioti unicellulari e nei batteri. Le globine (2/2) differiscono strutturalmente dalle globine (3/3) per: (i) la presenza di un’elica A più corta, (ii) un peptide non strutturato denominato pre-F, il quale sostituisce la canonica elica F delle globine (3/3), e (iii) l’eliminazione dell’elica D per formare un “loop” CD compatto. Sia le globine (3/3) che le globine (2/2) mostrano il gruppo eme avvolto in una tasca idrofobica tra le eliche E ed F. Il quinto ligando di coordinazione dell’atomo di ferro è il residuo di HisF8, detto “prossimale”. Sul versante distale dell’eme sono solitamente conservati i residui HisE7 (detto “distale”) e ValE11 che contribuiscono alla modulazione della reattività del centro metallico ed alla stabilità del ligando (endogeno o esogeno) legato all’eme. Negli ultimi venti anni, in numerosi organismi dai batteri ai vertebrati, sono state individuate emo-proteine caratterizzate da un folding “β-barrel” e dalla presenza di un eme ferrico coinvolto nel trasporto del monossido d’azoto (NO). Appartengono a questa famiglia : (i) le nitroforine (NP), una famiglia di proteine sintetizzate nelle ghiandole salivari dell’insetto ematofago Rhodnius prolixus, (ii) la nitroforina della Cimex lectularius (Cl-NP), (iii) l’α1-microglobulina umana (Hs-α1-m), una proteina appartenente alla famiglia delle lipocaline, (iv) la nitrobindina prodotta dalla pianta Arabidopsis thaliana (At-Nb), e (v) la nitrobindina umana (Hs-Nb), ortologa della At-Nb, identificata come dominio C-terminale della proteina THAP4. La struttura tridimensionale delle NP e dell’Hs-α1-m consiste in un “β-barrel” formato da otto filamenti β antiparalleli (contrassegnati dalla lettera A alla H) e tre corte α-eliche. At-Nb e Hs Nb, invece, mostrano un caratteristico “β-barrel” formato da dieci filamenti β antiparalleli in grado di legare l’eme. La struttura tridimensionale di Cl-NP evidenzia la presenza sia di α-eliche che di filamenti β, essendo strutturalmente correlata all’esonucleasi batterica III e all’inositolo polifosfato 5-fosfatasi umana. Nelle NP, in Hs-α1-m, e nelle nitrobindine At-Nb e Hs-Nb si osserva che: (i) il gruppo prostetico eme è stabilmente coordinato da un residuo di His “prossimale” (sostituito da un residuo di Cys in Cl-NP) all’interno di una cavità con parziale carattere idrofobico; (ii) manca il residuo di His distale, con conseguente perdita della reattività del centro metallico; (iii) l’eme è esposto al solvente, di conseguenza l’atomo di ferro è stabile nella forma ferrica selettiva verso piccole molecole neutre e anioniche (ad esempio l’NO). Poiché ad oggi la funzione delle nitrobindine non è ancora nota, lo scopo di questo lavoro di tesi è stato quello di caratterizzare strutturalmente e funzionalmente queste proteine e di chiarire la loro capacità di legare gas biatomici, studiare la loro reattività ed ipotizzare il loro ruolo biologico. Nella prima parte della tesi, la sequenza amminoacidica di At-Nb è stata usata come “input” in una ricerca BLAST che ha consentito di identificare, per omologia di sequenza, più di 20000 sequenze amminoacidiche lungo tutta la scala evolutiva. L’esame comparativo di queste sequenze (identità: >29%; omologia: >83%) ha permesso di evidenziare la conservazione dei residui amminoacidici coinvolti nel legame dell’eme e nella stabilizzazione del dominio nitrobindinico. Alcune di queste sequenze sono state poi scelte e modellate sia utilizzando un approccio per omologia (usando il programma Modeller e la struttura tridimensionale di At-Nb come templato) che una modellizzazione ab initio (mediante il server I-TASSER). I modelli strutturali delle ipotetiche Nb, come atteso, presentano dieci filamenti β organizzati a formare un “β-barrel” composto da tre regioni altamente conservate: (i) la tasca di legame dell’eme, al C-terminale, (ii) la regione centrale e (iii) l’α-elica 310, all’N-terminale. Per dimostrare un’indipendenza evolutiva delle Nb dalle NP, è stata poi condotta un’analisi filogenetica. L’albero filogenetico mostra che le NP e Nb appartengono a due cladi distinti supportando l’ipotesi che le Nb formino una nuova famiglia di emo-proteine non canoniche, presenti dal batterio all’uomo, evolutesi indipendentemente dalle NP. Nella seconda parte della tesi, la Nb di Mycobacterium tuberculosis (Mt-Nb) e la Nb di Homo sapiens (Hs-Nb) sono state espresse, purificate e caratterizzate spettrofotometricamente nella loro forma ferrica e ferrosa e in presenza di diversi ligandi (CO e imidazolo). Inoltre, le strutture cristallografiche di Mt-Nb senza ligando o in presenza del ligando cianuro, sono state risolte con una risoluzione atomica di 1,2 Å e 1,7 Å, rispettivamente. Queste strutture sono state poi confrontate con quelle di At-Nb (PDB: 3EMM) e di Hs-Nb (PDB: 3IA8). Analogamente alla At-Nb ed alla Hs-Nb, anche la Mt-Nb è caratterizzata da un “β-barrel” formato da 10 filamenti β antiparalleli in grado di legare l’eme. L’eme è coordinato dall’Nε dell’His155 ed è stabilizzato da molteplici interazioni di tipo van der Waals. Esperimenti di spettroscopia Raman hanno mostrato che, similmente alla Mb, a pH 7.0 le forme ferriche della Mt-Nb e della Hs-Nb sono specie esa-coordinate ad alto spin (6cHS) con una molecola di acqua in posizione distale, mentre le loro forme ferrose sono specie penta-coordinate ad alto spin (5cHS) con l’His prossimale che si coordina al ferro dell’eme. Allo scopo di determinare le costanti di velocità del legame del CO alla Mt-Nb(II) e alla Hs-Nb(II) sono stati condotti esperimenti di cinetica enzimatica mediante il metodo del mescolamento rapido (stopped flow) e la flash fotolisi. Poiché i risultati ottenuti hanno dimostrato che i complessi Mt-Nb(II)-CO e Hs-Nb(II)-CO non sono stabili, è stato escluso un coinvolgimento di queste proteine allo stato ferroso nel trasporto del gas. La caratterizzazione della capacità detossificante della Mt-Nb(III) e della Hs-Nb(III) nei confronti del perossinitrito ha consentito di dimostrare il ruolo di queste proteine nella conversione del perossinitrito a nitrato, così come nella protezione dei residui di Tyr dalla nitrazione indotta dal perossinitrito. Questi risultati portano ad ipotizzare che le nitrobindine giochino un ruolo fisiologico nella protezione contro le specie reattive dell’azoto. Come accennato precedentemente, la Hs-Nb costituice il dominio C-terminale di una proteina nucleare multi-dominio di 577 residui aminoacidici chiamata THAP4 (Thanaos associated protein 4). La regione N-terminale di THAP4 lega, mediante un dominio “zinc finger”, specifiche sequenze palindromiche posizionate a monte di geni implicati nella regolazione dell’apoptosi. In THAP4, il dominio Hs-Nb potrebbe riconoscere specie reattive dell’azoto e modulare l’attività del sito di legame al DNA con conseguente modulazione trascrizionale dei geni apoptotici. Sono in corso esperimenti di identificazione e caratterizzazione degli interattori fisiologici di THAP4, usando come modello la linea di cellule umane embrionali renali HEK293. I risultati ottenuti consentiranno di determinare se THAP4, ed in particolare il dominio nitrobindinico Hs-Nb, è coinvolta nei meccanismi cellulari di protezione contro gli effetti nocivi delle specie reattive.