Immunogen design and delivery : a new method based on exosomes

Abstract

I vaccini sono alleati importanti nella lotta a malattie di diversa natura; agiscono essenzialmente in due modi: alcuni favoriscono la produzione di anticorpi, altri stimolano risposte mediate dai linfociti T. La maggioranza dei vaccini terapeutici, quelli che devono contrastare una patologia già in essere, fanno parte di questo secondo gruppo. I vaccini che inducono la formazione di cellule T sono ultimamente diventati molto popolari; sono disegnati per stimolare lo sviluppo di linfociti CD4+ e CD8+ e non inducono, quindi, la formazione di anticorpi da parte delle cellule B. È Universalmente riconosciuto che questo tipo di vaccini sono necessari per contrastare alcune classi di patogeni nonché cellule tumorali. Le cellule cancerose posseggono diversi tipi di proteine che possono, in teoria, funzionare come antigeni; alcune sono proteine non mutate contro le quali non viene sviluppata tolleranza perché, ad esempio, sono espresse in quantità molto limitata; altre sono peptidi presenti solo nelle cellule neoplastiche e possono essere antigeni non self o neoantigeni. I primi sono peptidi che appartengono ai patogeni che causano il cancro (si pensi al virus del papilloma umano, HPV) e sono generalmente presenti in tutti gli individui affetti. I neoantigeni derivano invece da proteine create da mutazioni presenti nelle cellule cancerose, hanno quindi una sequenza peptidica unica (Schumacher T. N. & Schreiber R. D., 2015). Il cancro della cervice uterina è una malattia molto comune, è infatti il quarto tipo di cancro più comune fra le donne. Il virus del papilloma umano è considerato la causa della grande maggioranza di questi tumori. In molte lesioni HPV positive che evolvono in cancro il DNA virale è integrato nel genoma dell'ospite. Questo processo coincide spesso con la perdita di alcuni geni precoci (E1, E2, E4, e E5) e tardivi (L1 e L2). Questo fatto rende i vaccini profilattici inutili contro i tumori associati ad HPV, e infatti nessuno dei vaccini disponibili porta alla eradicazione dell'infezione e della malattia nelle donne già positive infette da HPV alla vaccinazione. Ciò è dovuto al fatto che questi vaccini consistono in preparazioni di virus-like particles (VLPs) contenenti l’epitopo L1 di diversi tipi virali. Le oncoproteine E6 ed E7 sono essenziali per la progressione dei tumori associati ad HPV e sono normalmente presenti nelle cellule trasformate; per queste ragioni sono considerate la principale fonte di antigeni per lo sviluppo di vaccini terapeutici che possano indurre la formazione di cellule T specifiche contro HPV. Diversi tentativi in questa direzione sono stati fatti utilizzando, ad esempio, vettori di vario tipo, proteine intere o peptidi. L'obiettivo è sempre quello di far esprimere alle cellule presentanti l’antigene (APC) antigeni derivati da E6 ed E7 così da attivare linfociti CD8+ citotossici o CD4+. E7 è la proteina più immunogenica e meglio caratterizzata, quindi molti dei vaccini terapeutici contro HPV sono basati su questo polipeptide. Diversi vettori virali sono stati usati per l'espressione di E6 ed E7, inclusi adenovirus, virus adenoassociati, lentivirus (Cassetti MC et Al., 2004), (Gomez-Gutierrez JG et Al., 2007). Un difetto comune dei vettori virali, in ogni caso, è la loro intrinseca immunogenicità, che spesso determina l'insorgenza di risposte dirette contro il vettore (Kaufmann AM et Al., 2002). Il progetto su cui questa tesi si basa mira allo sviluppo di una piattaforma per la somministrazione di antigeni del virus HPV basata sugli esosomi. Questi ultimi sono vescicole di diametro compreso fra 50 e 100 nm secreti dalle cellule nello spazio extracellulare o nei mezzi di coltura. Sono prodotti da moltissimi tipi cellulari e sono stati trovati in numerosi fluidi biologici, quali siero, urine, e plasma (Caby M.P. et Al., 2005). La nostra strategia si basa sull’uso di una proteina di HIV: Nef; una sua forma mutata (qui chiamata Nefmut) è infatti capace di inserirsi all'interno degli esosomi con alta efficienza e conserva questa capacità anche quando un'altra proteina viene fusa alla sua estremità C terminale (Lattanzi L, Federico M, 2012). Il nostro intento è quello di usare Nefmut per veicolare E7, attraverso gli esosomi, alle APC e indurre così una risposta immunitaria contro l'antigene scelto. Questo rimarrà all'interno delle vescicole e sarà, nelle nostre intenzioni, protetto da degradazione. Abbiamo già dimostrato che esosomi basati su Nefmut possono veicolare antigeni portando a cross-presentazione degli stessi ai linfociti CD8+. In questa tesi è mostrato come esosomi prodotti in vitro e contenenti la proteina di HPV E7 possano indurre una risposta immunitaria mediata da linfociti CD8+ quando vengano iniettati in topi immunocompetenti. La loro efficienza è comparabile a quella di VLP basate su HIV, ma contengono un'unica proteina virale. Due trattamenti con i nostri esosomi ingegnerizzati sono risultati sufficienti per rallentare la crescita di cellule tumorigeniche esperimenti E7 iniettate nei topi dopo l'immunizzazione. Le vescicole si sono dimostrate efficaci anche in un approccio terapeutico, sebbene ad un livello minore. Abbiamo quindi cercato dei protocolli che ci permettessero di aumentare l'ampiezza delle risposte immunitarie indotte, per far ciò abbiamo utilizzato un adiuvante: ISCOMATRIXTM. Questo si è dimostrato in grado di indurre una migliore cross presentazione dell'antigene in cellule linfoblastoidi e in cellule dendritiche immature. Anche in topi inoculati con ISCOMATRIXTM e esosomi contenenti la proteina di fusione Nefmut - E6, l'effetto dell’adiuvante nell'aumentare la risposta immunitaria contro E6 è apparso chiaro. Nonostante gli incoraggianti risultati ottenuti, ci è apparso chiaro come la produzione degli esosomi fosse resa difficile da problemi quali limitata riproducibilità e durata delle procedure di purificazione; abbiamo perciò pensato di ideare una strategia di immunizzazione basata sull'inoculo in topi di DNA plasmidico codificante per la proteina chimerica Nefmut-E7. La nostra idea era quella di indurre la produzione di esosomi endogeni, prodotti in primis dalle cellule muscolari, contenenti l'antigene virale. La produzione degli esosomi ingegnerizzati è stata confermata da analisi al FACS di vescicole derivate dal plasma di animali trattati con DNA codificante per Nefmut-GFP. I topi nei quali era stata indotta la produzione di vescicole contenenti E7 hanno sviluppato una risposta immunitaria specifica e sono risultati in grado di controllare la crescita di cellule esprimenti E7 in maniera più efficiente di quanto osservato immunizzando gli animali con gli esosomi prodotti in vitro. inoltre, le vescicole recuperate dal plasma degli animali trattati si sono rivelate immunogeniche quando reinoculate in topi naïve