Approach in aptamer based biosensors for human health applications

Abstract

Negli ultimi anni l’integrazione di diverse discipline scientifiche quali la bioelettronica, la genomica e le scienze informatiche, ha consentito la realizzazione di nuovi dispositivi analitici chiamati biosensori applicabili in svariati settori quali la diagnostica medica, ambientale o agroalimentare. I biosensori sono strumenti analitici in grado di convertire un’attività biologica in un segnale quantificabile di tipo elettrochimico, ottico o acustico, mediante la stretta integrazione di un elemento biologico sensibile, come ad esempio anticorpi, enzimi, DNA o cellule intere, ad un sistema strumentale di trasduzione e di analisi dei dati [Turner, et al., 1987]. Tali sistemi analitici sfruttano principalmente le caratteristiche di specificità, affinità e reattività di alcune molecole biologiche per un corrispondente ligando. In Fig. 1 è riportato lo schema generale secondo il quale operano i biosensori. L’analita da misurare reagisce con la molecola biologica sensibile, generalmente immobilizzata su un supporto integrato al trasduttore o direttamente su di esso, come ad esempio una fibra ottica o un chip di silicio, il quale misura la variazione di un parametro fisico e la reazione conseguente [Vo-Dinh T. and Cullum B., 2000]. I principali vantaggi nell'utilizzo dei biosensori sono: elevata specificità e sensibilità, semplicità nell'uso, basso costo della strumentazione, velocità di risposta, ridotto pretrattamento del campione, piccole dimensioni e facilità di trasporto per misurazioni in situ. Inoltre elementi immobilizzati di riconoscimento biologico possono essere rigenerati e riutilizzati per ripetute analisi [Lundström, 1994]. Le tecnologie che hanno portato allo sviluppo dei biosensori si sono successivamente evolute nella realizzazione dei microarray, che, di fatto, rappresentano delle matrici ordinate di elementi biologici sensibili. I microarray, consentono di monitorare molteplici interazioni biologiche contemporaneamente e di valutare le interazioni di tipo cinetico e non, tra l’elemento biologico (sonda) immobilizzato e il ligando in soluzione. In questo tipo di dispositivi analitici, microscopiche aree, costituite da molecole di cattura e disposte secondo specifici criteri, sono immobilizzate e allineate su un supporto. Questo rende possibile la determinazione in parallelo di migliaia di eventi biologici, attraverso un trasduttore o indicatore di altro genere, che trasformano la risposta numerica in un segnale acquisito [Scarano et al., 2010]. I biosensori insieme ai microarray fin dalle loro prime realizzazioni hanno mostrato un grande potenziale applicativo in vari campi tra i quali la diagnostica clinica, il monitoraggio ambientale e dei processi di fermentazione, le applicazioni militari e di difesa, il controllo della sicurezza degli alimenti. Dal momento che i biosensori sono costituiti da una componente biologica e da un sistema di trasduzione, in linea con le competenze tecnico-scientifiche precedentemente maturate, abbiamo deciso di focalizzare le ricerche svolte durante il dottorato principalmente sullo studio dell’elemento biologico sensibile, allo scopo di apportare nuove conoscenze sulle potenzialità applicative di molecole di differente affinità nella realizzazione di biosensori e microsistemi da destinare alla salute umana. A causa della necessità di doversi avvalere di diverse tecnologie ed attingere a competenze multidisciplinari, soprattutto per quanto riguardava la componente di trasduzione, le sperimentazioni sono state condotte in differenti laboratori. Presso il Centro Ricerche Casaccia dell’ ENEA, si sono messi a punto dei microarray, presso l’Università Comenius a Bratislava si sono studiati i biosensori QCM e presso l’Università di Roma Tre in collaborazione con il CNR, sono state preparate superfici sensibili per applicazioni in dispositivi SERS. Le sperimentazioni sono state ideate e condotte con il comune obiettivo di identificare quale fosse il migliore approccio tecnologico e metodologico di misura e quali fossero le prestazioni delle molecole di differente affinità utilizzabili per lo sviluppo di un nuovo biosensore applicabile alla tutela della salute. In un primo approccio abbiamo studiato un sistema microarray in condizioni standard con limiti di rilevabilità bassi e sviluppato un test immunologico in formato microarray per l'analisi simultanea di micotossine in particolare l’aflatossina e la fumonisina e le caspasi. La qualità dei dati di microarray è paragonabile ai dati risultanti dall’ immunosaggi basati sulle micropiastre (ELISA). Il nostro metodo potrebbe essere utilizzato come uno strumento semi-quantitativo per un rapido pre-screening, anche se sono necessarie ulteriori indagini al fine di migliorare le prestazioni strumentali in termini di sensibilità. In una fase successiva abbiamo introdotto nel nostro studio gli aptameri come elemento biosensibile (fig.2). Gli aptameri sono acidi nucleici caratterizzati da una specifica struttura tridimensionale, che si legano direttamente alla proteina target con un’ affinità all’analita paragonabile a quella degli anticorpi [Ellington and Szostak, 1990]. Nel nostro lavoro abbiamo usato, come sistemi modello, due diversi aptameri quello della trombina [Bock et al., 1992], spesso usato nella biosensoristica, e quello della ocratossina [Cruz-Aguado and Penner, 2008], in associazione con le loro proteine. I nostri esperimenti dimostrano che gli aptameri sono equivalenti agli anticorpi in termini di specificità e sensibilità. Abbiamo inoltre studiato i metodi acustici, come Quartz Crystal Microbalance (QCM) che permettono di misurare direttamente le interazioni ligando-recettore attraverso variazioni della massa sul quarzo. Con questo biosensore è possibile stimare la massa depositata in funzione della variazione della frequenza di oscillazione utilizzando l’equazione di Sauerbrey [Sauerbrey, 1959]. L’incremento della massa sul quarzo è inversamente proporzionale alla frequenza. Questo permette la rilevazione di tossine a basso peso molecolare e proteine. Inoltre è stato visto, durante questa fase sperimentale svolta a Bratislava, che le interazioni di legame aptamero-proteina dipendono dal giusto rapporto di ioni presenti in soluzione che sono probabilmente responsabili della stabilità e della formazione della struttura 3-D dell’ aptamero portatrice della stabilità e specificità del sito di legame. In confronto agli anticorpi, gli aptameri hanno diversi vantaggi, come l’elevate specificità e l’affinità, le ridotte dimensioni, sono inoltre sintetizzati chimicamente, quindi non sono necessari animali o colture cellulari e sono facilmente modificabili (marcatura con radioattivo, code fluorescenti e biotinilate). Il miglioramento della sensibilità, prodotta cambiando l'elemento selettivo (da anticorpi ad aptameri), è stata implementata ulteriormente, applicando un trasduttore diverso (da acustica a metodi ottici). Quindi abbiamo cercato di sviluppare una superficie sensibile Fig. 2: Struttura dell’aptamero a DNA che lega la trombina nel sito di legame per fibrinogeno [Hianik, 2009]. 4 per un biosensore ottico basato su metodo di analisi diretta e che non richiedesse modifiche del recettore, con l'obiettivo di superare i metodi di rilevamento indiretto studiati in letteratura. Abbiamo affrontato lo sviluppo di un sistema di rilevazione per tutti i tipi di analiti, proponendo una superficie sensibile per una camera microfluidica di un nanoaptasensor che si basa sulla spettroscopia SERS (Suface Enhanced Raman Spectroscopy). Tra i metodi di rilevamento ottico, la spettroscopia SERS si distingue per diversi vantaggi, tra i quali ci sono, la sensibilità, infatti, una singola molecola è in grado di portare cambiamenti nello spettro, e la specificità della sonda spettrale che è eccellente in confronto ai metodi in fluorescenza. I biosensori basati su aptameri che usano la spettroscopia SERS sono solitamente realizzati da una struttura, definita nella letteratura scientifica, sandwich: la proteina risulta inserita tra l’aptamero che lega il substrato e quello che invece è legato a sua volta alla sonda SERS, ad esempio una nano-particella d’oro, dando origine ad un arrangiamento che mostra la proteina analizzata nel mezzo come appunto in un sandwich [Sassolas et al., 2011]. Il limite di questo sistema è sicuramente quello di avere diversi passaggi prima della reale misura. Al fine di superare questo inconveniente abbiamo sviluppato una superficie sensibile che consente di utilizzare come ultimo stadio la deposizione della molecola target per eseguire un’analisi diretta di campioni biologici. In conclusione, abbiamo studiato diversi approcci sperimentali per lo sviluppo di superfici biosensibili dei biosensori. In primo luogo, abbiamo sviluppato un metodo rapido, multi - parametrico, sensibile e poco costoso per la rilevazione di micotossine per la sicurezza alimentare e per le applicazioni di caspasi nella salute dell’uomo. In seguito lo studio è progredito alla messa a punto di un bioreceptor diverso, scegliendo aptameri come elemento selettivo, studiando la sensibilità del metodo QCM. Infine, abbiamo progettato una superficie sensibile per un diverso metodo di rilevazione quale il metodo ottico (SERS), che avesse una maggiore sensibilità rispetto ai metodi acustici. Questo miglioramento finale potrebbe consentire la possibilità di presentare un futuro brevetto.