Study of the role of System Xc- in neuroinflammation and neurodegenerative diseases

Abstract

Free radical production and oxidative stress play an important role in the pathogenesis of various neurodegenerative diseases, including HIV-associated neurocognitive disorders (HANDs) and Alzheimer’s disease (AD). Oxidative stress is defined as an imbalance between the production of pro-oxidant molecules, for example reactive oxygen species (ROS), and antioxidant system, such as intracellular glutathione (GSH) production, in favor of pro-oxidant molecules. In several cell types including astrocytes, ROS can trigger a protective antioxidant cell response through the transcriptional induction of phase II detoxifying and antioxidant genes (i.e. ARE genes). Several transcription factors are involved in these cellular defence processes, including nuclear factor erythroid 2 related factor 2 (Nrf2), that has a fundamental role against oxidative stress. Among other ARE genes, System Xc - plays a critical role in the manteinance of GSH homeostasis, because it transports simultaneously a glutamate out of the cell and a cystine into the cell, where it is reduced in cysteine, and it is used for the synthesis of GSH. We hypothesize a double role of System Xc - transporter in CNS: on the one hand, System Xc - has a protective role towards astrocytes due to the production of GSH; on the other hand, System Xc - could be dangerous towards bystanding neurons, because of its ability to export glutamate in extracellular space that could induce excitotoxicity and neuronal death. Accordingly, in a lot of neurodegenerative diseases, for example HAND and AD, System Xc - antiporter could have a pivotal role. Our previous findings indicate that the HIV protein Tat, endogenously produced in astroglial cells, can induce an effective antioxidant response mediated by Nrf2 and ARE-driven gene expression. In this study, we demonstrated for the first time that Tat-induced neurotoxicity is mediated by the increase of glutamate release due to astrocytic System Xc - up-regulation. Free radical production and oxidative stress play pivotal role also in Alzheimer’s disease. First, we analyzed the effect of amyloid-β (Aβ) in astrocytes. We found that Aβ is able to induce Nrf2 nuclear translocation and, consequently, to increase the transcription of ARE genes. In particular, Aβ is able to induce up-regulation of System Xc - . We found that Aβ-induced antioxidant response was not able to protect astrocytes from death, indeed we demonstrated a significant reduction of astrocytes viability, regardless of the System Xc - activity. Once the response in astrocytes was characterized, we evaluated the effects of Aβ directly on neuronal cells cultured alone. First, we found that neurons were not able to activate Nrf2/ARE pathway, however, despite the lack of Nrf2 activation, System Xc - protein and mRNA were up-regulated in differentiated SH-SY5Y neuronal cells treated with Aβ (50 µM) for 24 hours. Second, we observed that treatment with Aβ did not interfere with neuronal cell viability. Successively, we explored the role of astrocytic response to Aβ in neuronal viability. Although the induction of Nrf2-driven gene expression has been widely indicated as a protective mechanism to counteract the effects of oxidative stress, in many cell types such as astrocytes, the up-regulation of xCT elicited by Nrf2 could be a potential source for excitotoxicity due to excessive glutamate release. We investigated the effect of Aβ-induced astrocytic antioxidant response on neuronal cell viability, focusing in particular on the role of System Xc - . In order to study the effect of astrocytic System Xc - activation on surrounding neurons, we performed co-cultures with U373 and differentiated SH-SY5Y cells. The co-culture system represents a better tool for understanding the role played by astrocytes in mediating neuronal protection or toxicity. The up regulation of System Xc - can increase extracellular glutamate release and potentially cause excitotoxicity. Thus, we wondered whether astroglial cells treated with Aβ (50 µM) were able to release higher levels of glutamate in the extracellular space in comparison to control cells. As expected, Aβ treated cells released 50% more glutamate than untreated cells. We found that SSZ treatment prevented Aβ-induced glutamate release, reducing its levels in extracellular space. These findings clearly indicate that astroglial cells treated with Aβ induce an increased glutamate release by eliciting System Xc - up-regulation. Moreover, we demonstrated that at 24 hours post-treatment there is a significant 50% less viability of differentiated SH-SY5Y cells and a significant 35% less viability of U373 cells than the respective control cells. To verify whether the reduced neuronal viability, induced by Aβ, was effectively due to the increased export of glutamate through System Xc - transporter, we performed an MTT assay on co-cultures treated for 24 hours with Aβ alone or in the presence of SSZ. SSZ was able to prevent neuronal toxicity, restoring cell viability at the control level. These findings demonstrate for the first time that Aβ-induced neurotoxicity is mediated by an increase of glutamate release due to System Xc - up-regulation in astroglial cells. Moreover, our findings demonstrate also that Aβ-induced neurotoxicity is mediated by the activation of NMDA receptor in neuronal cells, as indicated by the effect of NMDA receptor inhibitor that was able to restore neuronal viability. Given the involvement of astrocytes in CNS pathology, it is not surprising that the ability to exacerbate neurodegeneration through the conversion of oxidative stress to excitotoxicity via system Xc - has been linked to a variety of disorders, including Alzheimer’s disease. The present study shed light on Nrf2/system Xc - pathway and may help to better understand the role of astrocytes as the cell population responsible for the bulk of the neuronal death in Alzheimer’s disease.

Lo stress ossidativo e la produzione di radicali liberi giocano un ruolo importante nella patogenesi di varie malattie neurodegenerative, come la neurodegenerazione associata all’HIV (HAND) e il morbo di Alzheimer (AD). Lo stress ossidativo è definito come uno squilibrio tra la produzione di molecole pro-ossidanti, ad esempio le specie reattive dell'ossigeno (ROS), e il sistema antiossidante, come la produzione di glutatione intracellulare (GSH), a favore delle molecole pro-ossidanti. In diversi tipi cellulari, inclusi gli astrociti, le ROS possono innescare una risposta antiossidante attraverso la trascrizione di geni detossificanti e antiossidanti di fase II (i geni ARE). Tra i fattori coinvolti nella trascrizione di tali geni troviamo nuclear factor erythroid 2 related factor 2 (Nrf2), principale regolatore della risposta contro lo stress ossidativo. Tra i geni ARE, il trasportatore System Xc - svolge un ruolo critico nel mantenimento dell'omeostasi del GSH, in quanto trasporta contemporaneamente una molecola di glutammato fuori dalla cellula e una di cistina all’interno della cellula, dove viene ridotta in cisteina ed utilizzata per la sintesi di GSH. In questo lavoro di tesi è stato studiato il ruolo del trasportatore System Xc - nel contesto della neuroinfiammazione e della neurodegenerazione. In particolare, è stato ipotizzato un duplice ruolo del System Xc - nel sistema nervoso centrale: da una parte, un ruolo protettivo nei confronti degli astrociti, visto il suo coinvolgimento nella produzione di GSH; dall'altra, un effetto dannoso per i neuroni circostanti, a causa della sua capacità di esportare glutammato il quale, accumulandosi nell’ambiente extracellulare, potrebbe causare eccitotossicità e morte neuronale. Di conseguenza, in molte malattie neurodegenerative, come HAND e AD, il System Xc - potrebbe avere un ruolo cruciale. Nel nostro laboratorio, in precedenza, era stato dimostrato che la proteina Tat dell’HIV, prodotta negli astrociti, può indurre in tali cellule l’attivazione di una efficiente risposta antiossidante, ossia del pathway Nrf2/geni ARE responsabile dell’aumento di espressione del trasportatore System Xc - . Successivamente, nel lavoro svolto per la presente tesi è stato dimostrato per la prima volta che negli astrociti che producono Tat (U373-Tat) aumenta il rilascio di glutammato nell’ambiente extracellulare. Il trattamento con sulfasalazina (SSZ), uno specifico inibitore del System Xc - , riporta il rilascio di glutammato ai livelli del controllo (U373-mock), dimostrando che l’effetto è causato dall’up-regolazione del System Xc - . Dato che il glutammato extracellulare può causare eccitotossicità, abbiamo valutato la vitalità neuronale in condizioni di co coltura, e il risultato ha mostrato che i neuroni (cellule SH-SY5Y) in co-coltura con le U373-Tat presentano una vitalità ridotta rispetto al controllo, rappresentato da cellule SH-SY5Y coltivate insieme a U373 che non producono la proteina Tat (SH-SY5Y/U373-mock). Come atteso il trattamento con SSZ ha ripristinato la vitalità ai livelli del controllo. Questi risultati dimostrano per la prima volta che la neurotossicità indotta da Tat è mediata da un aumento del rilascio di glutammato a causa della up-regolazione del System Xc - nelle cellule astrogliali. La produzione di radicali liberi e lo stress ossidativo svolgono un ruolo chiave anche nel morbo di Alzheimer. Importante nello sviluppo della patologia è la proteina β-amiloide (Aβ). Come prima cosa abbiamo studiato l’effetto del Aβ negli astrociti (cellule U373) e abbiamo dimostrato che è in grado di indurre un incremento della traslocazione nucleare di Nrf2 e, di conseguenza, un aumento della trascrizione dei geni ARE, tra cui: GCL, HO-1, SOD1, SOD2, GPX, CAT e System Xc - . In particolare, Aβ causa negli astrociti un’aumentata espressione del System Xc - sia a livello trascrizionale che proteico; al contrario, l’espressione di SOD1 e CAT a livello proteico risulta ridotta. Tuttavia la risposta antiossidante indotta da Aβ non è in grado di proteggere gli astrociti dalla morte. Abbiamo osservato infatti una significativa riduzione della vitalità, che non viene ripristinata ai livelli del controllo in seguito a trattamento con la SSZ, indicando che gli astrociti muoiono in seguito a trattamento con Aβ indipendentemente dall'attività del System Xc - . Successivamente, abbiamo studiato l’effetto del Aβ nei neuroni (cellule SH-SY5Y differenziate) e abbiamo dimostrato che, in seguito a trattamento con Aβ, i neuroni non sono in grado di attivare il pathway Nrf2/geni ARE. Osserviamo infatti una ridotta traslocazione di Nrf2 nel nucleo, che tuttavia non impedisce l’attivazione di una risposta antiossidante, dimostrata da un aumento di espressione degli mRNA di alcuni geni antiossidanti. Tra questi troviamo il System Xc - , per il quale è stato osservato anche un aumento a livello proteico. È stato dimostrato che Aβ non influisce sulla vitalità neuronale, mentre la SSZ è in grado di ridurla, dimostrando che il System Xc - ha un ruolo fondamentale nella protezione dei neuroni dalla morte. Per ultimo, abbiamo studiato l'effetto della risposta antiossidante indotta dal Aβ negli astrociti sulla vitalità neuronale, concentrandoci in particolare sul ruolo del System Xc - . Per valutare l’effetto dell’attivazione del System Xc - negli astrociti sui neuroni circostanti, abbiamo eseguito i successivi esperimenti in condizioni di co-coltura astrociti/neuroni. Il Aβ causa un aumento del rilascio di glutammato da parte degli astrociti in co-coltura in seguito all’up-regolazione del System Xc - in tali cellule, infatti la SSZ è in grado di riportare i livelli di glutammato pari al controllo. Inoltre, abbiamo dimostrato che Aβ causa morte neuronale in co-coltura, e che co-trattamenti con SSZ ed MK801, un’antagonista del recettore NMDA, sono in grado di prevenire la neurotossicità ripristinando la vitalità neuronale a livello del controllo. Questi risultati dimostrano per la prima volta che la neurotossicità indotta dal Aβ è mediata da un aumento del rilascio di glutammato in seguito all’up-regolazione del System Xc - negli astrociti e dall'attivazione, da parte del glutammato rilasciato nell’ambiente extracellulare, del recettore NMDA delle cellule neuronali. Concludendo, questo lavoro di tesi sottolinea l’importanza della via di segnale Nrf2/System Xc - e può aiutare a comprendere meglio il ruolo degli astrociti come popolazione cellulare responsabile della maggior parte della morte neuronale nelle malattie neurodegenerative, tra cui HAND e AD.