Hijacking bacterial iron metabolism using the post-transition metal gallium

Abstract

The inexorable rise in the incidence of antibiotic resistance in bacterial pathogens, coupled with the disappointingly low discovery rate of new and clinical useful antibiotics, has revised the attention on searching for alternatives to conventional antibacterial drugs. Considering the essential role of iron in bacterial physiology and pathogenicity, iron metabolism constitutes a promising but still poorly-exploited therapeutic target for the development of new treatments (Ballouche et al., 2009; Foley and Simeonov, 2012). In the last years, the repurposing of existing Food and Drug Administration (FDA)-approved drugs for new clinical applications has become a major research area in drug discovery. In this context, the post-transition metal gallium [Ga(III)], that has a long history as a diagnostic and chemotherapeutic agent, was recently repurposed as an antibacterial (Rangel-Vega et al., 2015; Soo et al., 2017). Ga(III) has no proven function in biological systems, but acts as an iron-mimetic by replacing iron in many enzymes, impairing their function and ultimately hampering cell growth (Bonchi et al., 2014; Minandri et al., 2014; Goss et al., 2018). Recently, there has been an expansion in the number of Ga(III)-based drugs displaying therapeutic potential, categorized in first-, second-, and third- generations of Ga(III) formulations, and ranging from simple salts such as Ga(III)-chloride (GaCl3) and Ga(III)-nitrate (GaN), through metal-organic complexes such as Ga(III)-maltolate (GaM) (Bernstein et al., 2000), and Ga(III)-protoporphyrin IX (GaPPIX) (Chitambar, 2017). To investigate the effect of Ga(III) on Gram-negative bacteria, Pseudomonas aerugionsa was used as model of human pathogen. This bacterium represents an important nosocomial pathogen implicated in a wide range of hospital infections, especially in critically ill and immunocompromised patients, and the leading cause of chronic lung infections in patients suffering from cystic fibrosis (CF). Moreover, P. aeruginosa is intrinsically resistant to many classes of antibiotics, making the treatment of infected patients very problematic. In the first part of this PhD thesis, the possibility of improving the anti-P. aeruginosa potency of Ga(III) by complex formation with PPIX (GaPPIX), that is actively up-taken by bacterial cells, was investigated. We demostrated that GaPPIX enters bacterial cells exclusively through the heme uptake systems, primarily through phu system. Moreover, we provided evidences that GaPPIX inhibits the aerobic growth of P. aeruginosa by targeting cytochromes, thus interfering with cellular respiration. Although P. aeruginosa is one of the most frequent cause of multidrug-resistance nosocomial infections, other pathogens belonging to the ESKAPE group (Enterococcus faecium, Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae, Acinetobacter baumannii, and Enterobacter species) have reached an alarmingly high level of resistance, and infections caused by these pathogens are no longer treatable with conventional antibiotic therapies (Deplano et al., 2005; Elemam et al., 2009; Nowak et al., 2017). At present, there are no comparative data on the activity of Ga(III) against ESKAPE species under standard test conditions, representing a major pitfall to the repurposing of Ga(III) as last-resort antibacterial agent. This consideration prompted us to investigate the inhibitory activity of Ga(III) on all pathogens belonging to the ESKAPE group, using not only GaPPIX but other two Ga(III)- based compounds, the most widely studied GaN, and the orally-active compound GaM, which is endowed with high bioavailability and low toxicity (Bernstein et al., 2000). Therefore, in the second part of this PhD thesis, the antibacterial activity of GaN, GaM and GaPPIX was investigated on a representative panel of ESKAPE pathogens, in three media characterized by different nutrients and iron content, namely: i) Mueller-Hinton broth (MHB), the standard medium used to determine the minimum inhibitory concentration (MIC) of antimicrobial agents; ii) iron-depleted MHB (DMHB) (Hackel et al., 2018); and iii) RPMI-1640 tissue culture medium supplemented with 10% complement-free human serum (RPMI-HS), to better mimic the in vivo environment encountered by bacteria during infections (Antunes et al., 2012; Thompson et al., 2012; Bonchi et al., 2015). We have defined suitable test conditions to assess the antibacterial activity of Ga(III) compounds in vitro (i.e., RPMI-HS medium), and we found that ESKAPE pathogens are more susceptibile to Ga(III) compounds (MIC < 32 µM) in RPMI-HS compared with MHB and DMHB. In contrast, we demonstrated that GaPPIX lost its antibacterial activity in RPMI-HS, likely due to the presence of albumin, which binds GaPPIX, due to its similarity with heme, and counteracts GaPPIX inhibition. Moreover, we provided evidence that the presence of multiple heme-uptake systems strongly influences GaPPIX susceptibility. Interestingly, we showed that GaN and GaM exhibit a bacteriostatic effect, whereas GaPPIX exerts a bactericidal activity on some strains. As anticipated, P. aeruginosa is also the leading cause of CF lung infection and the resulting of lung function deterioration. However, CF lung infections are sequential and sometimes composed of diverse bacterial pathogens, such as Achromobacter xylosoxidans, Burkholderia cepacia complex (Bcc), Haemophilus influenzae, S. aureus, Stenotrophomonas maltophilia, and Streptococcus pneumoniae, that coexist and evolve in the airways of CF patients (Folkesson et al., 2012; Filkins and O’Toole, 2015; Parkins and Floto, 2015). The eradication of such infections is nearly impossible, due to the frequent and prolonged antibiotic administration, that exerts selective pressure for antibiotic resistance (López-Causapé et al., 2013, 2015). Furthermore, if not treated, lung infections often become chronic, since generally associed with bacterial biofilm formation, becoming nearly impossible to eradicate with conventional antibiotics. The broad spectrum activity of Ga(III) on the ESKAPE pathogens, together with the anti-biofilm activity previously demonstrated for Ga(III) (Bonchi et al., 2014; Minandri et al., 2014; Runci et al., 2016), have prompted us to investigate the inhibitory activity of Ga(III) on CF-associated pathogens. In the last part of this PhD thesis, we have investigated the antibacterial activity of GaN, GaM and GaPPIX on a representative collection of CF-associated pathogens, using standard media and biological fluids-mimetic growth media, such as RPMI-HS (Hijazi et al., 2018), and the Artificial Sputum Medium (ASM; Kirchner et al., 2012). Combining data obtained in all media tested, we found that Ga(III)-based compounds were effective against all CF-associated pathogens, except S. pneumoniae. Interestingly, some species (i.e., S. aureus and H. influenzae) were found to be extremely susceptible only to GaPPIX, while the other species were susceptible to more then one Ga(III)-based compounds. In the worrisome scenario of expanding drug resistance among bacterial pathogens, our findings on the antibacterial activity of Ga(III) could open the way to valuable therapeutic options to cure otherwise untreatable bacterial infections.

A causa dell’utilizzo indiscriminato degli antibiotici nella terapia convenzionale e la conseguente inarrestabile diffusione dell’antibiotico resistenza in numerose specie batteriche, negli ultimi anni, una maggior attenzione è stata dedicata alla ricerca di terapie antibatteriche alternative agli antibiotici. Dato il ruolo essenziale che il ferro esercita sulla crescita e sulla patogenicità batterica, il metabolismo del ferro rappresenta un promettente bersaglio per lo sviluppo di nuove molecole antibatteriche (Ballouche et al., 2009; Foley and Simeonov, 2012). Negli ultimi anni, inoltre, il riutilizzo o la riproposizione di farmaci approvati dalla Food and Drug Administration (FDA) per nuovi usi clinici ha ampliato il campo di ricerca per la scoperta di nuovi farmaci. In questo contesto, il metallo di post-transizione gallio [Ga(III)], in passato utilizzato sia come antineoplastico che per il trattamento di patologie legate al metabolismo del tessuto osseo, è stato recentemente riproposto come molecola antibatterica (Rangel-Vega et al., 2015; Soo et al., 2017). È stato dimostrato come il Ga(III), grazie all’elevata somiglianza chimico-fisica con il ferro [Fe(III)], sia in grado di interferire con i processi ossido-riduttivi ferro-dipendenti delle cellule microbiche, alterandone il metabolismo e inibendone di conseguenza la crescita. La maggior parte dei sistemi biologici, infatti, non è capace di distinguere il Fe(III) dal Ga(III) a causa delle loro caratteristiche subatomiche molto simili (Bonchi et al., 2014; Minandri et al., 2014; Goss et al., 2018). Recentemente inoltre, il numero di formulazioni del Ga(III) con un potenziale terapeutico è cresciuto, con farmaci definiti di prima, seconda e terza generazione, che spaziano dai semplici sali di questo metallo come il cloruro di Ga(III) (GaCl3) e il nitrato di Ga(III) (GaN), ai complessi metallo-organici come Ga(III)-maltolato (GaM) (Bernstein et al., 2000), e Ga(III)-protoporfirina IX (GaPPIX) (Chitambar, 2017). Per studiare l’effetto del Ga(III) su batteri Gram-negativi, è stato scelto come batterio modello Pseudomonas aeruginosa, che oggi rappresenta un preoccupante agente di infezioni nosocomiali, e la principale causa di infezioni polmonari croniche nei pazienti affetti da fibrosi cistica (FC). P. aeruginosa è naturalmente resistente alle principali classi di antibiotici, il che ne compromette in ultimo il trattamento delle infezioni. In questa tesi, è stato studiato se l’effetto inibitorio del Ga(III) potesse essere aumentato quando complessato con PPIX (GaPPIX), molecola attivamente internalizzata da P. aeruginosa. È stato infatti osservato come il GaPPIX sia in grado di entrare nella cellula tramite i sistemi dell’acquisizione dell’eme, principalmente tramite il sistema phu. Inoltre, è stato evidenziato come il GaPPIX inibisca la crescita aerobica di P. aeruginosa interferendo con i citocromi, e in ultimo con la respirazione cellulare. Sebbene P. aeruginosa rappresenti una delle cause più frequenti di infezioni nosocomiali multi resistenti, altri patogeni appartenenti al gruppo ESKAPE (Enterococcus faecium, Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae, Acinetobacter baumannii, and Enterobacter species) hanno raggiunto un livello di resistenza allarmante, rendendo intrattabili le infezioni causate da questi agenti patogeni con le convenzionali terapie antibiotiche (Deplano et al., 2005; Elemam et al., 2009; Nowak et al., 2017). Inoltre, la mancanza di studi puntuali sull'attività del Ga(III) sulle specie ESKAPE in saggi standard, rappresenta un importante limite nell’utilizzo del Ga(III) come agente antibatterico. Per questo motivo, in questo lavoro di tesi, è stata saggiata l'attività inibitoria del Ga(III) sui patogeni appartenenti al gruppo ESKAPE. Oltre al precedentemente citato GaPPIX, altri due composti del Ga(III) sono stati scelti, il GaN, ampiamente studiato in letteratura, e il GaM, un composto attivo oralmente e dotato di un’elevata biodisponibilità oltre che di una bassa tossicità (Bernstein et al., 2000). Nella seconda parte di questa tesi, è stato dunque saggiato l’effetto inibitorio del GaN, GaM e GaPPIX su un pannello rappresentativo di patogeni ESKAPE, in tre terreni caratterizzati da diversi nutrienti e contenuto in ferro: i) il terreno standard Mueller-Hinton (MHB), comunemente utilizzato per determinare la minima concentrazione inibente dei agenti antimicrobici; ii) il MHB ferro-privo (DMHB) (Hackel et al., 2018); e iii) il RPMI-1640, addizionato con il 10% di siero umano (RPMI HS), che tende a simulare le condizioni incontrate in vivo dai batteri durante le infezioni (Antunes et al., 2012; Thompson et al., 2012; Bonchi et al., 2015). Sono state definite le condizioni idonee per valutare l'attività antibatterica dei composti di Ga(III) in vitro (i. e., in RPMI-HS), ed è stato dimostrato come in RPMI-HS i patogeni ESKAPE siano più suscettibili ai composti del Ga(III) (MIC < 32 µM) rispetto che in MHB o in DMHB. Tuttavia, è stato dimostrato un importante decremento dell’attività antibatterica del GaPPIX in RPMI-HS, probabilmente a causa della presenza dell’albumina umana, che potrebbe legare il GaPPIX a causa della sua somiglianza con l'eme, e neutralizzare quindi il suo effetto inibitorio. Inoltre, sono stati fornite evidenze di come la presenza di più sistemi per l’acquisizione dell'eme influenzi fortemente la suscettibilità al GaPPIX. Infine, è stato dimostrato l’effetto batteriostatico del GaN e GaM, e le proprietà battericide del GaPPIX. Come precedentemente anticipato, P. aeruginosa rappresenta anche la principale causa d’infezione polmonare e di deterioramento della funzionalità polmonare in pazienti FC. Tuttavia, le infezioni polmonari in FC sono sequenziali e talvolta polimicrobiche, ossia causate contemporaneamente di batteri patogeni appartenenti a generi e specie diverse [come Achromobacter xylosoxidans, Burkholderia cepacia complex (Bcc), Haemophilus influenzae, S. aureus, Stenotrophomonas maltophilia, and Streptococcus pneumoniae], che coesistono e si evolvono nelle vie respiratorie dei pazienti della FC (Folkesson et al., 2012; Filkins and O’Toole, 2015; Parkins and Floto, 2015). Nel trattamento di queste infezioni, la frequente e prolungata somministrazione di antibiotici, che esercita sui patogeni una pressione selettiva determina lo sviluppo di resistenze agli antibiotici, rende l’eradicazione di queste infezioni virtualmente impossibile (López-Causapé et al., 2013, 2015). Inoltre, le infezioni polmonari non trattate spesso cronicizzano e sono generalmente associate alla formazione di biofilm batterici impossibili da eradicare con gli antibiotici convenzionali. L'attività ad ampio spettro dei composti del Ga(III) sui patogeni ESKAPE, e l’attività anti-biofilm precedentemente dimostrata per il Ga(III) (Bonchi et al., 2014, Minandri et al., 2014; Runci et al., 2016), ci hanno spinto a saggiare l'attività inibente del Ga(III) sui patogeni associati alla FC. Nella terza e l’ultima parte di questo lavoro di tesi è stato saggiato l’effetto dei GaN, GaM e GaPPIX su un pannello rappresentativo di specie caratteristiche dell’infezione in FC, sia nei terreni standard che nei quelli che mimano i fluidi biologici, come RPMI-HS (Hijazi et al., 2018) e l’Artificial Sputum Medium (ASM; Kirchner et al., 2012). È stato dimostrato che i tre composti del Ga(III) sono in grado di inibire la crescita batterica di tutti i patogeni associati alla FC, ad eccezione di S. pneumoniae. In particolare, è stato dimostrato che alcune specie (S. aureus e H. influenzae) sono ipersensibili esclusivamente al GaPPIX, mentre gli altre specie sono suscettibili a più di un composto a base di Ga(III). I risultati sull’attività antibatterica del Ga(III) ottenuti in questo lavoro di tesi fanno ben sperare per un possibile impiego del Ga(III) nel trattamento di infezioni batteriche altrimenti incurabili.

L’usage exagéré et inapproprié des antimicrobiens a accélèré l'apparition et la propagation de la résistance aux antibiotiques chez de nombreuses espèces bactériennes. Par conséquent, une attention particulière a été accordée récemment à la recherche des solutions alternatives. Étant donné le rôle essentiel du fer [Fe(III)] dans la croissance et la pathogénicité bactérienne, le métabolisme du Fe(III) a été évalué comme une cible possible pour le développement de nouvelles molécules antibactériennes (Ballouche et al., 2009; Foley and Simeonov, 2012). Au cours des dernières années, la réutilisation des médicaments approuvés par la Food and Drug Administration (FDA) pour de nouvelles applications cliniques, est devenue un important domaine de recherche dans la découverte de nouveaux médicaments. Dans ce contexte, le métal de post-transition gallium [Ga(III)], connu come un agent de diagnostic et chimiothérapeutique, a été réutilisé récement comme antibactérien (Rangel-Vega et al., 2015; Soo et al., 2017). En fait, la plupart des systèmes biologiques ne sont pas capables de distinguer le Fe(III) de Ga(III) en raison de leurs caractéristiques subatomiques très similaires. De ce fait, en remplaçant le Fe(III) dans de nombreuses enzymes, le Ga(III) altère leur fonction et bloque par la suite la croissance cellulaire (Bonchi et al., 2014; Minandri et al., 2014; Goss et al., 2018). Récemment, le nombre des composés à base de Ga(III), présentant un potentiel thérapeutique, a augmenté. Parmi ces composés, classifiés en première-, deuxième- et troisième- générations de formulations de Ga(III), se trouvent des sels simples tels que le chlorure de Ga(III) (GaCl3) et le nitrate de Ga(III) (GaN), ou des complexes métallo-organiques, tels que le Ga(III)-maltolate (GaM) (Bernstein et al., 2000) et le Ga(III)-protoporphyrine IX (GaPPIX) (Chitambar, 2017). Pour étudier l'effet de Ga(III) sur les bactéries à Gram-négatif, Pseudomonas aeruginosa a été choisi comme modèle d'agent pathogène humain. Il s’agit de l’une des principales causes d’infections nososcomiales, ainsi que d’infections pulmonaires chroniques chez les personnes atteintes de mucoviscidose. En outre, P. aeruginosa est intrinsèquement résistant à de nombreuses classes d’antibiotiques, ce qui rend très problématique le traitement des patients infectés. Dans ce travail de thèse, la possibilité d'améliorer la capacité anti-P. aeruginosa du Ga(III) a été étudiée, en utilisant un complexe de Ga(III), à savoir GaPPIX, qui est activement absorbé par cette bactérie. Nous avons démontré que le GaPPIX pénètre dans la cellule bactérienne, exclusivement en empruntant les voies specifiques de l’acquisition de l'hème, en particulier par le système phu. Nous avons également démontré que le GaPPIX entrave la croissance de P. aeruginosa en ciblant les cytochromes de la respiration cellulaire aerobie. Bien que P. aeruginosa soit l'une des causes les plus fréquentes d'infections nosocomiales multirésistantes, d'autres agents pathogènes appartenant au groupe ESKAPE (Enterococcus faecium, Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae, Acinetobacter baumannii, et Enterobacter species) ont atteint un niveau alarmant de résistance, rendant difficile le traitment de ces infections par les antibiotiques conventionnels (Deplano et al., 2005; Elemam et al., 2009; Nowak et al., 2017). Jusqu’à présent, la manque de données comparatives sur l'activité du Ga(III) sur les espèces du groupe ESKAPE dans des conditions standard de test, pose un problème pour la réutilisation de Ga(III) comme un agent antibactérien de dernier recours. Pour cette raison, en plus de GaPPIX, deux autres composés ont été selectionnés, à savoir, le GaN, plus largement étudié, et le GaM, oralement actif et doté d'une biodisponibilité élevée ainsi que d'une faible toxicité (Bernstein et al., 2000). Dans ce travail de thèse, l’activité antibactérienne des trois composés GaN, GaM et GaPPIX a été étudiée sur les bactéries pathogènes du groupe ESKAPE, dans trois milieux de croissance caractérisés par différents nutriments et teneur en fer, à savoir, i) le Mueller-Hinton (MHB), milieu de culture standard utilisé pour évaluer l’activité in vitro des agents antimicrobiens; ii) le MHB appauvri en fer (DMHB) (Hackel et al., 2018); et iii) le milieu de culture RPMI-1640 contenant 10% de sérum humain (HS) sans complément (RPMI-HS), représentant des conditions plus proches de celles rencontrées in vivo par les bactéries durant l'infection (Antunes et al., 2012; Thompson et al., 2012; Bonchi et al., 2015). Nous avons défini les conditions in vitro d'essai appropriées pour évaluer l'activité antibactérienne du Ga(III), représentées par le milieu RPMI-HS, dans lesquel nous avons constaté que les agents pathogènes ESKAPE sont plus sensibles aux composés de Ga(III) (MIC < 32 µM) par rapport au MHB et au DMHB. En revanche, nous avons démontré que le GaPPIX perd son activité antibactérienne dans le milieu RPMI-HS, probablement à cause de la présence d’albumine, qui pourrait se lier au GaPPIX, en raison de sa similitude avec l’hème, et freiner par la suite son effet inhibiteur. Nous avons également démontré que la présence de multiples systèmes d'acquisition de l'hème influence fortement la sensibilité au GaPPIX. Un fait intéressant, nous avons montré que les composés GaN et GaM provoquent un effet bactériostatique, alors que GaPPIX exerce une activité bactéricide. P. aeruginosa est également la principale cause des infections pulmonaires ainsi que de la détérioration des fonctions pulmonaires chez les patients atteints de la mucoviscidose. Cependant, les infections pulmonaires de la mucoviscidose sont polymicrobiennes, soit causées par divers agents pathogènes, tels que Achromobacter xylosoxidans, Burkholderia cepacia complex (Bcc), Haemophilus influenzae, S. aureus, Stenotrophomonas maltophilia, et Streptococcus pneumoniae, qui coexistent et évoluent dans les voies respiratoires des ces patients (Folkesson et al., 2012; Filkins and O’Toole, 2015; Parkins and Floto, 2015). L'éradication de telles infections est presque impossible, en raison de l'administration fréquente et prolongée d'antibiotiques, qui par la suite exerce une pression sélective sur les bactéries et engendre ainsi la résistance aux antibiotiques (López-Causapé et al., 2013, 2015). De plus, si ces infections échappent au traitment, elles deviennent souvent chroniques, et sont généralement associées à la formation de biofilms bactériens, impossibles à éradiquer avec les antibiotiques conventionnels. L'activité à large spectre du Ga(III) sur les agents pathogènes ESKAPE, ainsi que l'activité anti-biofilm précédemment démontrée pour le Ga(III) (Bonchi et al., 2014; Minandri et al., 2014; Runci et al., 2016), nous ont incité à étudier son activité inhibitrice sur les agents pathogènes associés à la mucoviscidose. Dans la dernière partie de cette thèse, nous avons étudié l'activité antibactérienne des composés GaN, GaM et GaPPIX, sur une liste representative des agents pathogènes associés à la mucoviscidose, en utilisant des milieux de culture standards ainsi que ceux reproduisant les conditions des fluides biologiques, tels que RPMI-HS (Hijazi et al., 2018) et l’artificial sputum medium (ASM; Kirchner et al., 2012). Nous avons démontré que les trois composés de Ga(III) sont capables d'inhiber la croissance bactérienne de tous les agents pathogènes associés à la mucoviscidose, à l'exception de S. pneumoniae. En particulier, nous avons démontré que certaines espèces (ex. S. aureus et H. influenzae) sont hypersensibles exclusivement au GaPPIX, tandis que les autres espèces ont démontré une sensibilité à plus d’un seul composé de Ga(III). Dans le scénario inquiétant de l’augmentation de la résistance aux antibiotiques chez les bactéries pathogènes, nos résultats sur l’activité antibactérienne du Ga(III) pourraient ouvrir la voie à de nouvelles options thérapeutiques pour guérir des infections bactériennes autrement intraitables.