Please use this identifier to cite or link to this item: http://hdl.handle.net/2307/40915
Title: The role of TRP receptors in the signalling pathways in Hydra Vulgaris
Other Titles: Ruolo dei recettori TRP nella modulazione delle vie di segnalazione in Hydra Vulgaris
Authors: Russo, Valeria
Advisor: Colasanti, Marco
Keywords: HYDRA VULGARIS
TRP RECEPTORS
Issue Date: 25-Feb-2019
Publisher: Università degli studi Roma Tre
Abstract: Transient Receptor Potential (TRP) receptors represent a newly identified superfamily of cationic membrane channels that show a great diversity of activation mechanisms and selectivity. Their structure consists of six transmembrane domains that form a central pore, in addition to different amino acid and carboxylic domains that impart differential sensitivity to various sensory stimuli, including temperature, touch and smell, making them able to promote more biological functions (Clapham, 2003). In mammals, 33 different TRP channels have been identified, while in the marine invertebrates, nematodes and fruit flies, 30, 24 and 16 different TRP channels were respectively spotted. This family of receptors is indeed present in different vertebrate and invertebrate cells, but the way in which the TRP channels have evolved over the years remains largely unknown. Previously, our studies have demonstrated the expression of the TRPM3 receptor (a member of the melastatin subfamily) in Hydra vulgaris, a small freshwater polyp belonging to the Phylum of Cnidaria, Hydrozoa class, at the base of the evolutionary chain. Specifically, we found that TRPM3 was able to mediate the heat dependent induction of HSP70, NOS, Nrf2 and SOD expression, genes usually involved in signaling of noxious heat also in mammals (Malafoglia., et al 2016). The major aim of the PhD research was to demonstrate a direct involvement of TRPA1 receptor (a member of the ankyrin subfamily) in the modulation of the thermal shock response (i.e., cold shock) and the primary immune response in Hydra vulgaris. Regarding the cold shock, polyps were treated with harmful cold 4°C at different time points. The cold-induced TRPA1 activation caused the up-regulation of NOS, Nrf2 and SOD gene expression, as measured by RT-qPCR analysis. In particular, we observed a significant increase of mRNA expression in all genes, between 90 min and 12 h. The direct involvement of the TRPA1 receptor was verified by using a specific TRPA1 inducer (Glybenclamide G0639), and a potent and selective TRPA1 inhibitor (HC 030031). The optimal concentrations of drugs were selected after repeated dose-response experiments. Overall, these results indicate an involvement of the TRPA1 receptor in the activation pathway of thermal shock response. It has been demonstrated that Hydra presents molecular models of innate immunity; Toll-like receptors (TLRs) are membrane receptors and Nod-like receptors (NLRs) are cytoplasmic sensors. The functional interaction of TLR and NLR mediated by a ligand induces the innate immune response, with the production of known antimicrobial peptides, such as periculin and hydramacin (Augustin et al., 2010). Some studies have shown a connection between TRP receptors (e.g., TRPA1) and the primary immune response in mammals (Chul-Kyu Park et al., 2014). Furthermore, some authors support the idea of a specific role for TRPA1 channels in detection and response to harmful bacterial and viral products (Meseguer et al., 2014). Thus, we decided to test TRPA1 involvement in primary immune response pathways in H. vulgaris, by analysing mRNA over-expression of genes (e.g., NF-κB, NOS, periculin and hydramacin), after treatment of polyps with cell lysates of P. aeruginosa PA14 for 24 h. Again, the TRPA1 antagonist HC-030031 reverted PA14-induced mRNA expression of the above-mentioned genes, thus suggesting that TRPA1 receptor plays a role in modulating the immune response. In a parallel research, we decided to address an evolutionary aspect of aging. Hydra represents a unique animal model for the absence of cellular aging and senescence as well as for its high regenerative capacities, properties that may be related to the fact that these animals have mainly stem cells (Bode, 2003). Furthermore, Hydra has unique properties including apparent biological immortality. In this respect, a study on individual lifespan in H. vulgaris provides evidence that members of this species are not subject to senescence (Martínez, 1998). For continuous growth, a telomerase activity is required; telomerase activity is repressed in most human somatic cells, while its activity is higher in immortal cell lines, germ cells, stem cells, activated lymphocytes and most of the tumor cells. Thus, we decided to verify the presence of telomerase activity in H. vulgaris, using the TRAP (Telomere repeat amplification protocol) assay. Specifically, specimens were repeatedly cut in two parts and the telomerase activity were analyzed after body regeneration. Interestingly, we found that the constant treatment of polyps with epigallocatechin gallate (EGCG), the most abundant catechin in green tea, induced a considerable reduction of telomerase activity when compared with untreated polyps. Note that after two weeks from cut, a decrease in regenerative rate was also observed in samples treated with EGCG with respect to untreated specimens, thus suggesting a possible correlation between reduced telomerase activity and the induction of senescence in H. vulgaris. However, this hypothesis, although intriguing, remains to be further investigated.
I recettori Transient Receptor Potential (TRP) costituiscono una superfamiglia recentemente identificata di canali di membrana cationici che mostrano una grande diversità di meccanismi di attivazione e selettività. La loro struttura consiste di sei domini transmembrana che formano un poro centrale, oltre a diversi domini amminoacidici e carbossilici che impartiscono sensibilità differenziale a vari stimoli sensoriali, tra cui temperatura, tatto e olfatto, che li rendono in grado di promuovere più funzioni biologiche (Clapham, 2003). Nei mammiferi sono stati identificati 33 diversi tipi di TRP, mentre negli invertebrati marini, nematodi e moscerini della frutta ne sono stati identificati rispettivamente, 30, 24 e 16. Questa famiglia di recettori è infatti presente in diverse cellule di vertebrati e invertebrati, ma il modo in cui si sono evoluti rimane in gran parte sconosciuto. Studi precedentemente condotti nel nostro laboratorio hanno evidenziato l’espressione di TRPM3 (un membro della sottofamiglia dei TRP melastatinici) in Hydra vulgaris, un piccolo polipo di acqua dolce appartenente al Phylum degli Cnidari, classe Hydrozoi, alla base della scala evolutiva. Nello specifico, abbiamo osservato come TRPM3 sia coinvolto nell’induzione dopo shock termico (34°C) dell’espressione di HSP70, NOS, Nrf2 e SOD, geni usualmente coinvolti nelle vie di segnalazione durante shoch termico doloroso nei mammiferi (Malafoglia., et al 2016). Gli esperimenti condotti durante il percorso di dottorato hanno avuto come obiettivo primario quello di dimostrare un’associazione diretta del recettore TRPA1 (un membro della sottofamiglia dei TRP ankirinici) nella modulazione dei pathways coinvolti nella risposta allo shock termico (in particolare al freddo) e nella risposta immunitaria primaria in Hydra vulgaris. Per quanto riguarda lo shock termico, i polipi sono stati sottoposti a 4°C per differenti tempi. L’attivazione del recettore in seguito allo stimolo freddo ha provocato la modulazione dell’espressione dei geni NOS, Nrf2 e SOD, come verificato dall’analisi della RT-qPCR. In particolare, abbiamo osservato un incremento significativo di tutti i geni tra 90 minuti e 12 ore. Per valutare il coinvolgimento diretto del recettore TRPA1 è stato utilizzato l’agonista specifico Glybenclamide G0639, come controllo positivo, e l’antagonista HC-030031 (Babes et al., 2013). Le concentrazioni ottimali sono state individuate in seguito a ripetuti esperimenti dose/risposta. In particolare, l’aumentata espressione genica indotta da freddo o dalla Glybenclamide è stata riportata ai livelli di controllo in seguito al trattamento con l’antagonista selettivo di TRPA1, HC-030031. Nell’insieme questi risultati indicano un coinvolgimento del recettore TRPA1 nella via di attivazione della risposta allo shock termico. Recentemente, è stato dimostrato che Hydra presenta dei modelli molecolari di immunità innata; i recettori Toll-like (TLR) sono recettori di membrana e i recettori Nod-like (NLR) sono sensori citoplasmatici. L'interazione funzionale di TLR e NLR mediata da un ligando, induce la risposta immunitaria innata, con la produzione di peptidi antimicrobici, come ad esempio periculina e hydramicina (Augustin et al., 2010). Alcuni studi hanno dimostrato una connessione tra i recettori TRP, in particolare il TRPA1, e la risposta immunitaria primaria (Chul-Kyu Park et al., 2014). Altri autori supportano l’idea di un ruolo specifico per i canali TRPA1 nel rilevamento e nella risposta a prodotti batterici e virali (Meseguer et al., 2014). Per queste ragioni, abbiamo voluto studiare il coinvolgimento del recettore TRPA1 nella modulazione della risposta immunitaria in Hydra vulgaris, analizzando l’espressione di NF-κB e dei geni NF-κB-dipendenti come ad esempio NOS, periculina e hydramacina, dopo trattamento delle idre con lisati cellulari di P. aeruginosa PA14 per 24 h. Anche in questo caso, l’antagonista HC-030031 è stato in grado di inibire l’espressione dei suddetti geni, suggerendo come il TRPA1 giochi un ruolo importante anche in questo meccanismo. Parallelamente al precedente studio, abbiamo affrontato un aspetto evolutivo dell’invecchiamento e della senescenza cellulare. L’Hydra rappresenta un modello sperimentale unico per l’assenza di senescenza cellulare e invecchiamento e per la sua elevata capacità di rigenerazione, proprietà legata al fatto che questi animali posseggono prevalentemente cellule staminali. Inoltre, l’Hydra possiede proprietà uniche tra cui un’apparente immortalità biologica. Uno studio sulla durata della vita individuale in H. vulgaris ha mostrato che membri di questa specie non sono soggetti a senescenza (Martínez, 1998). È noto che per una continua crescita, è richiesta l’attività della telomerasi per mantenere costante la lunghezza dei telomeri. Infatti, l’attività telomerasica è repressa in molte cellule somatiche umane, mentre è elevata in cellule germinali, staminali, in cellule immortali e in molte cellule tumorali. Cosi, abbiamo voluto verificare la presenza di attività telomerasica in Hydra vulgaris, utilizzando il saggio TRAP (Telomere repeat amplification protocol). In particolare, gli animali sono stati ripetutamente tagliati e dopo la rigenerazione è stata evidenziata una intensa attività telomerasica. A questo proposito, abbiamo osservato che trattando le idre, precedentemente tagliate, con epigallocatechina gallato (EGCG), la catechina più abbondante nel tè verde e potente inibitore della telomerasi, l’attività telomerasica era fortemente ridotta. È importante sottolineare che dopo due settimane dal taglio, è stato osservato un rallentamento della capacità rigenerativa delle idre trattate con EGCG, suggerendo una possibile associazione tra una ridotta attività telomerasica e l’induzione della senescenza nell’Hydra. Ovviamente, questa intrigante ipotesi necessità di essere ulteriormente verificata e confermata.
URI: http://hdl.handle.net/2307/40915
Access Rights: info:eu-repo/semantics/openAccess
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T - Tesi di dottorato

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