Modulation of telomere stability and radiation sensitivity in in vitro and in vivo systems

Abstract

Radiotherapy (RT) is one of the standard treatments of a wide range of cancers. Cells killing by radiation is based on production of unrepairable lesions involving DNA double-strand breaks (DSBs). Nevertheless, conventional RT, which involves ionizing radiation (IR), with or without the combination of chemotherapy, is not sufficient to increase the overall survival of patients suffering from radioresistant tumors such as glioblastoma multiforme (GBM) (WHO grade IV glioma). GBM is one of the most common and lethal primary malignant brain tumors in adults. Standard treatment includes maximal surgical resection followed by concurrent radiation and chemotherapy with temozolomide (TMZ), with the aim to kill the remain tumor cells. Unfortunately, recurrences after treatment are very frequent, and the outcome remain very poor. Failure of radiotherapy make necessary to investigate possible mechanisms responsible for resistance, to enable the success of treatments. Radioresistance in cancer cells could be ascribed to several possible mechanisms. It has been proposed a correlation between radiosensitivity and telomere dysfunction. Telomeres are nucleoprotein complex situated at the end of the linear eukaryotic chromosomes that consists of tandem repeats of TTAGGG non-coding sequences. Their primary role is to protect the natural ends of chromosomes, and thus to maintain genome stability. Mechanisms involved in telomere maintenance and function are promising targets for the development of selective molecules for cancer therapy. Furthermore, due to the repetitive nature of their guanine-rich sequences, telomeres tend to rearrange in unusual DNA conformations such as G-quadruplex (G4). We aim with this work to test different compounds proposed to target and stabilize telomeric G4s, to induce telomere architecture disruption. Proteins involved in telomere function and maintenance are also involved in DNA damage response (DDR). We indeed aim to interfere with DDR mechanisms, to sensitize cells to the damage induced by IR. We first evaluated the biological effectiveness of three different naphthalene diimide (NDI) derivatives (C1, C2 and C6) as inhibitors of cell proliferation in U251MG glioblastoma (GBM) cells and human primary fibroblast (AG01522), in comparison to RHPS4, a G4-ligand that already proved its ability to target telomeres and to induce radiosensitization. All the G4 ligands used, showed a strong cytotoxic effect on the cancer cell line, with calculated IC50 in the range of nanomolar, and exerted a lower cytotoxicity in the normal cell line, making all the compounds good candidates to investigate any hypothetic telomeric-related radiation sensitizer role. However, when we performed a panel of experiments aimed to investigate telomeric effects of the ligands, such as telomere length analysis, induction of telomere dysfunctional foci (TIF) and shelterin proteins analysis, we noticed that NDIs caused only mild telomere dysfunction, contrary to RHPS4. Indeed, in the combined treatment of cancer cells with G4s stabilizing compounds and IR, NDIs failed to enhance the effects of IR in GBM cells. Only RHPS4 showed a synergist effect, as obtained from survival curves and long-term growth assays, after 5 days of treatment and reaching 6 Gy of X-rays irradiation. Data from the induction of DDR after irradiation, by the analysis of the IR-induced foci (IRIF), confirmed that NDIs did not affect DNA repair in contrast to RHPS4. Those results prompt us to study other possible target of G4s ligands to uncover the reasons of such different behavior in sensitize cells to IR. We tested the amounts of proteins encoded by genes involved in DNA repair, replication stress (RS) and cell cycle regulation, harboring putative G4s within their sequences. Among all the targets tested, we found some very interesting variations. The ATR-CHK1 mediated DNA damage response is thought to be the main RS responsive pathway that mediates cellular DNA damage checkpoint responses in S-phase. Both ligands, NDIs and RHPS4, modulate the levels of pATR and pCHK1. One proposed shared mechanism is the possibility that G4 compounds induced RS. In line with this observation, we found modulation of other proteins involved in cell cycle progression and checkpoint, such as cyclin A and E for NDIs, and PCNA and CDK2 for RHPS4. Those results suggested that the presence of stabilized G4s within genomic sequences could physically impede the correct progression of replication fork, thus inducing cell cycle perturbation. We confirmed the detrimental effects in cell cycle, studying the incorporation of BrdU analog during S-phase, in cells treated for 5 days. Data confirmed a strong delay in S-phase for all the ligands, but RHPS4 was the only one able to block persistently cells even 48 h after ligand washout. We therefore confirmed RHPS4 in vitro radiosensitizing effect in GBM radioresistant cells through the targeting and dysfunctionalization of telomeres. We decided to go further and show that the combination of RHPS4 administration (10mg/kg/die for 5 days) and IR (10 Gy X-rays in a single dose) exposure was very effective also in vivo, blocking tumor growth in mice as evaluated up to 65 days in a heterotopic xenograft model. The reduction of tumor volume and the long-term tumor control observed in mice exposed to combined treatment suggested the targeting of both the bulk differentiated tumor mass and stem cell compartment. Several studies have been focused on the validation of Cancer Stem Cells (CSCs) which are believed to be responsible of the long-term progression, and recurrence of the tumor. To dissect the RHPS4 mechanism of action in differentiated vs cancer stem cells, in vitro experiments were performed in stem-like neurospheres derived from U251MG and in four well-characterized patient-derived GSCs. Interestingly, in both systems, RHPS4 alone was able to strongly reduce cell proliferation but, unexpectedly, combined treatment with IR did not determine any increased effect. The lacking of the radiosensitization was supported by the GSCs telomeric-resistance to RHPS4 observed as the total absence of telomere-involving chromosomal aberrations. The mechanism by which RHPS4 targets the stem compartment remains to be elucidated but, interestingly, RHPS4 treatment determined a strong reduction of RAD51 and CHK1 protein level and gene expression. We propose that RHPS4 inhibits stem cell growth by the direct or indirect targeting of genes involved in RS response and Homologous Recombination (HR). This determines a deficient RS response that increases the yield of replication fork stall in case of stabilized G4. A mechanism proposed for the resolution of stalled replication forks is the replication fork reversal, which is prompted by the activity of the HR protein RAD51. The most accepted mechanism indicates that an endonuclease cleaves DNA at stalled fork and determines the formation of a one-ended DSB that in turn activates RAD51-mediated recombination. However, in GSCs, the concomitant RHPS4-induced depletion of RAD51 and CHK1 determines the failure in reversal of the stalled replication fork leading, in turn, to collapse and DSB induction, even before the genotoxic effect of IR is appreciable. Nonetheless, the proliferation effects remain very high even in the stem component, making RHPS4 a good candidate for therapeutic approaches. To finally further clarify the RHPS4 RS consequences, we decided to target, with a genomic approach, a RecQ helicase, BLM, involved in the unwinding of G4 at telomeric stalled replication fork. G4 stabilization could enhance the RS in absence of players needed for the unwinding, such as BLM, even if we need further experiments to clarify the effect. Overall, our data indicate that G4-ligands are powerful antiproliferative in tumor-differentiated cells, and some ligands are also radiosensitizer through telomere targeting, and could inhibit GSCs proliferation in a telomere-independent manner.

La radioterapia rappresenta il trattamento standard di una vasta gamma di tumori. Le radiazioni uccidono le cellule mediante la formazione di lesioni irreparabili nel genoma, quali rotture a doppio filamento del DNA. Tuttavia, la radioterapia convenzionale, che coinvolge l’uso di radiazioni ionizzanti (RI), in combinazione o meno con chemioterapia, non è sufficiente ad aumentare la sopravvivenza complessiva di pazienti affetti da tumori radioresistenti, quali ad esempio il Glioblastoma multiforme (GBM) (glioma di IV grado secondo la WHO). Il GBM è il più comune e letale tra i tumori cerebrali primari maligni negli adulti. Il trattamento convenzionale include la resezione chirurgica massimale seguita da trattamento con radiazioni in combinazione con l’uso del chemioterapeutico temozolomide (TMZ), con l’obiettivo di uccidere le rimanenti cellule tumorali. Sfortunatamente, le recidive dopo trattamento solo molto frequenti, e l’esito della malattia rimane nefasto. L’inefficacia della radioterapia rende necessario studiare i possibili meccanismi responsabili della radioresistenza, per permettere il successo dei trattamenti. La radioresistenza delle cellule tumorali può essere attribuita a diversi meccanismi. È stata proposta una correlazione tra radiosensibilità e disfunzionalità telomerica. I telomeri sono strutture nucleoproteiche situate alle estremità dei cromosomi lineari eucariotici, consistono di ripetizioni in tandem della sequenza non codificante TTAGGG. Il loro ruolo primario è proteggere le estremità naturali dei cromosomi, e quindi mantenere la stabilità genomica. I meccanismi coinvolti nel mantenimento e nella funzionalità del telomero rappresentano promettenti target per lo sviluppo di molecole selettive per le terapie antitumorali. Inoltre, data la natura ripetitive delle loro sequenze ricche in guanina, i telomeri tendono a riorganizzarsi in inusuali conformazioni del DNA, quali i G-quadruplex (G4). L’obiettivo di questo lavoro è testare diversi composti in grado di stabilizzare i G4 telomerici, per indurre una perturbazione dell’architettura del telomero. Proteine coinvolte nelle funzioni e nel mantenimento del telomero partecipano inoltre anche alla risposta al danno al DNA. Miriamo difatti ad interferire con i meccanismi di risposta al danno, per sensibilizzare le cellule al danno indotto da radiazioni ionizzanti. Per prima cosa abbiamo valutato l’efficacia biologica di tre differenti derivati del naftalene dimide (NDI) (C1, C2 e C6), nell’inibire la proliferazione nella linea cellulare di GBM, U251MG e in fibroblasti umani primari, AG01522, comparando con l’effetto di RHPS4, un ligando del G4 precedentemente dimostratosi in grado di bersagliare i telomeri e ndurre radiosensibilizzazione. Tutti i ligandi del G4 utilizzati hanno mostrato un forte effetto citotossico sulle cellule tumorali, con valori calcolati per la concentrazione inibente il 50% della crescita nel range del nanomolare, e tutti mostrano una ridotta citotossicità nella linea cellulare normale, facendo di questi composti ottimi candidati per lo studio di ipotetici effetti radiosensibilizzanti in correlazione al telomero. Tuttavia, nell’effettuare un pannello di esperimenti con lo scopo di studiare gli effetti telomerici dei ligandi, quali l’analisi della lunghezza telomerica, l’induzione di foci telomerici disfunzionali e l’analisi dei livelli delle proteine shelterine, abbiamo notato come gli NDI causassero solamente una lieve disfunzionalità telomerica, contrariamente a RHPS4. Infatti, nel trattamento combinato delle cellule tumorali con agenti stabilizzanti i G4 e radiazioni ionizzanti (RI), gli NDI non sono riusciti a migliorare gli effetti delle radiazioni nelle cellule di GBM. I risultati ottenuti dalle curve di sopravvivenza e dal saggio di crescita a lungo termine (in cellule trattate per 5 giorni e irraggiate con una dose di 6 Gy di raggi X), hanno confermato RHPS4 come unico ligando in grado di dare un effetto sinergico nel trattamento combinato. I dati sull’induzione di risposta al danno al DNA dopo irraggiamento, ottenuti tramite l’analisi dei foci di danno indotti da RI, confermano come gli NDI non influenzino la riparazione del DNA, in contrapposizione con RHPS4. Questi risultati ci hanno spinto a studiare altri possibili target dei ligandi dei G4, per scoprire le ragioni di un comportamento così diverso nel sensibilizzare le cellule alle RI. Abbiamo testato i livelli di proteine codificate da geni coinvolti nella riparazione del DNA, nello stress replicativo (SR) e nella regolazione del ciclo cellulare, che presentano putativi G4 nelle loro sequenze. Tra tutti i target testati, abbiamo trovato alcune variazioni molto interessanti. La risposta al danno al DNA mediata da ATR-CHK1 è considerata il principale pathway di risposta allo SR, mediante la regolazione dei checkpoint della fase S. Entrambi i ligandi, NDI e RHPS4, modulano i livelli di ATR e CHK1 fosforilati. Un meccanismo comune proposto coinvolge la possibilità che i ligandi del G4 inducano SR. In linea con questa osservazione troviamo la modulazione di altre proteine coinvolte nella regolazione e progressione del ciclo cellulare, come le cicline A e E per gli NDI, PCNA e CDK2 per RHPS4. Questi risultati suggeriscono come la presenza di G4 stabilizzati nelle sequenze genomiche possa costituire un impedimento fisico alla corretta progressione della forca replicativa, inducendo così una perturbazione del ciclo cellulare. Abbiamo confermato gli effetti deleteri sul ciclo cellulare, mediante lo studio dell’incorporazione dell’analogo BrdU durante la fase S, nelle cellule dopo 5 giorni di trattamento. I dati ottenuti confermano un forte rallentamento della fase S per tutti i ligandi, ma RHPS4 è l’unico capace di bloccare persistentemente le cellule persino 48 ore dopo la rimozione della sostanza. Abbiamo confermato così gli effetti radiosesibilizzanti di RHPS4 in vitro nelle cellule radioresistenti di GBM, mediante il bersaglio e la disfunzionalizzazione del telomero. Abbiamo deciso di spingerci oltre e mostrate come la combinazione della somministrazione di RHPS4 (10mg/kg/die per 5 giorni) e l’esposizione alle RI (10 Gy in singola dose) fosse altrettanto efficace in vivo, bloccando la crescita del tumore nei topi, come valutato fino a 65 giorni in modelli xenograft eterotopici. La riduzione del volume del tumore e il controllo del tumore a lungo termine osservati nei topi esposti a trattamento combinato, hanno suggerito il targeting sia della massa tumorale differenziata che del compartimento delle cellule staminali. Diversi studi si sono focalizzati sulla validazione delle Cellule Staminali Cancerose (CSC), che si ritiene essere responsabili della progressione a lungo termine del tumore e delle recidive. Per dissezionare il meccanismo di azione di RHPS4 nelle cellule differenziate versus le staminali tumorali, sono stati effettuati esperimenti in vitro, in neurosfere rappresentati le staminali, derivate dalle U251MG, e in 4 linee staminali ben caratterizzate, derivate da paziente. Curiosamente, in entrambi i modelli, il singolo trattamento con RHPS4 è stato in grado di ridurre fortemente la proliferazione cellulare, ma inaspettatamente, il trattamento combinato con le RI non ha determinato nessun incremento dell’effetto. La mancanza di radiosensibilizzazione è supportata dalla resistenza telomerica a RHPS4 delle staminali, osservata nella totale mancanza di aberrazioni cromosomiche derivanti dal telomero. Il meccanismo attraverso il quale RHPS4 colpisce il compartimento staminale rimane da elucidare ma, interessante è notare come il trattamento con RHPS4 determini una forte riduzione dei livelli proteici e dell’espressione genica di RAD51 e CHK1. Ipotizziamo che RHPS4 inibisca la crescita delle cellule staminali mediante il targeting diretto o indiretto di geni coinvolti nella risposta allo SR e nella ricombinazione omologa. Questo determina una risposta deficitaria allo SR, che aumenta la resa dello stallo della forca replicativa in caso di G4 stabilizzati. Uno dei meccanismi proposti per la risoluzione delle forche replicative in stallo è l’inversione della forca, mediato dalla proteina della ricombinazione omologa RAD51. La forca stallata viene processata da una endonucleasi, ed esposta come una rottura a doppio filamento del DNA, che attiva la ricombinazione mediata da RAD51. Tuttavia, nelle cellule staminali tumorali di glioma, RHPS4 induce una deplezione di RAD51e CHK1, determinando l’impossibilità di avviare il processo di reversione della forca e risoluzione dello stallo replicativo, portando al collasso della forca e induzione di danno al DNA, ancor prima che sia apprezzabile l’effetto genotossico delle radiazioni ionizzanti. Tuttavia i soli effetti sulla proliferazione rimangono molto alti anche nella componente staminale, rendendo RHPS4 un buon candidato per futuri approcci terapeutici. Per chiarire ulteriormente le conseguenze di RHPS4 sullo SR, abbiamo deciso di utilizzare un approccio genomico per silenziare una RecQ elicasi, BLM, coinvolta nello svolgimento dei G4 telomerici alle forche replicative stallate. La stabilizzazione dei G4 potrebbe aumentare lo SR in assenza di componenti necessarie alla loro risoluzione, quali BLM, anche se ulteriore sperimentazione è ad oggi necessaria per chiarirne l’effetto. Complessivamente i nostri dati indicano come i ligandi dei G4 siano potenti agenti antiproliferativi nelle cellule tumorali differenziate, e come alcuni di essi siano anche agenti radiosensibilizzanti, mediante il targeting del telomero, e possano inoltre inibire la proliferazione della componente staminale tumorale, indipendentemente dai telomeri.