Please use this identifier to cite or link to this item:
Title: The Arabidopsis amine oxidases expressed in tissues and cells involved in water transport and water loss play a role in stomatal closure and xylem phenotypic plasticity under hormone treatments and abiotic stress
Other Titles: Le amino ossidasi in Arabidopsis, espresse nei tessuti e nelle cellule coinvolte nel trasporto idrico e nella perdita di acqua, svolgono un ruolo nella chiusura stomatica e nella plasticità fenotipica dello xilema dopo trattamenti ormonali o in condizioni di stress abiotico
Issue Date: 24-Jan-2020
Publisher: Università degli studi Roma Tre
Abstract: Polyamines (PAs) are ubiquitous, low-molecular-weight aliphatic compounds, present in all living organisms and essential for cell growth and differentiation. The fine regulation of their biosynthetic and catabolic pathways as well as conjugation and transport processes ensure an accurate homeostasis of PA cellular levels, supporting the biological relevance of these compounds. In plants, the most common PAs are the triamine spermidine (Spd), the tetramine spermine (Spm) and their diamine precursor putrescine (Put). Regarding their physiological role, it has been suggested that PAs play important roles in many developmental processes, including morphogenesis, growth, differentiation and senescence. PAs are catabolized through terminal or back-conversion metabolism giving rise to an amine moiety, an amino-aldehyde and H2O2, by two different classes of enzymes belonging to the amine oxidase (AO) family, the monomeric FAD-containing polyamine oxidases (PAOs) and the homodimeric copper-containing amine oxidases (CuAOs). In the model organism of flowering plants Arabidopsis thaliana, ten putative genes annotated as CuAOs (AtCuAO) are present, of which only five have been characterized for substrate specificity, subcellular localization and regulation of gene expression. The apoplastic AtCuAO (formerly AtAO1; At4g14940) and AtCuAO1 (formerly AtCuAO1; At1g62810), the peroxisomal AtCuAO2 (formerly AtCuAO8; At1g31690) and AtCuAO3 (formerly AtCuAO2; At1g31710) and AtCuAO (formerly AtCuAO3; At2g42490) all oxidize Spd at the primary amino group with an affinity comparable to that for Put (AtCuAO1, AtCuAO2 and AtCuAO3) or slightly lower (AtCuAO and AtCuAO). In addition to regulating the concentration of PAs in plant cells, AOs also contribute to important physiological processes through their reaction products, aminoaldehydes, DAP and H2O2, which is a shared compound of all the AO-catalyzed reactions and has a key role in both development and defense responses against biotic and abiotic stresses. In details, cell-wall localized AOs contribute to the constitutive and inducible defense responses against biotic stress inducing wall-stiffening events through H2O2 production in the apoplast and may play a key role as a mediator in the final events needed to accomplish full xylem differentiation, namely secondary wall deposition and developmental programmed cell death (PCD). Moreover, in responses to biotic and abiotic stresses, ABA induces the production of H2O2 in guard cells leading to stomatal closure. A well-known source of H2O2 in the cell-wall of guard cells is represented by plasma membrane NADPH oxidases, but recently it has been shown that the H2O2 produced by apoplastic catabolism of PAs can also be involved. The aim of the present work is to highlight the physiological roles played by six Arabidopsis CuAOs (encoded by the respective genes AtCuAOα2, AtCuAOα3, AtCuAOβ, AtCuAOγ1, AtCuAOγ2 and AtCuAOδ) during stress responses. To this purpose, transgenic Arabidopsis plants expressing AtCuAO::green fluorescent protein-β-glucuronidase (GFP-GUS) constructs, as well as both AtCuAOβ and AtCuAOδ insertional loss-of-function mutant plants have been exploited. Particularly, in order to lay the basis for future research on AtCuAO physiological roles, a comprehensive and extensive analysis of the expression patterns of the six AtCuAO under treatment with different stress related hormones (ABA, MeJA, SA) and IAA as well as after abiotic stress like wounding and dehydration were investigated by both quantitative analysis (RT-qPCR) and qualitative approaches (AtCuAOs-promoter::GFP-GUS transgenic plants). Concerning the physiological roles, the previously reported expression of AtCuAOβ in guard cells, together with its MeJA-inducible expression in xylem tissues, suggests a role of this gene in homeostatic mechanisms leading to a balance between xylem-dependent water-supply and stomata-dependent water-loss under stress conditions. Stomatal closure may represent a fast response to injury followed by remodeling of xylem tissue allowing plant acclimation to adverse conditions. Considering this, the involvement of AtCuAOβ in stomatal closure and xylem differentiation upon leaf or root wounding have been investigated, with particular attention to its possible involvement in systemic responses. Additionally, the known role played by the vacuole in ABA-induced stomatal closure, along with the occurrence of an ABA-inducible AtCuAOδ expression in guard cells, led us to analyze the possible involvement of the vacuolar AtCuAOδ in the control of stomatal movement. Regarding AtCuAOβ, data herein reported showed an increase in AtCuAOβ expression levels upon both leaf or root wounding and after treatment with the wound-signal-hormone MeJA, supporting its prominent role in mechanical damage responses. Moreover, histochemical assays showed that MeJA treatment, as well as cotyledonary leaf wounding and root wounding, induced AtCuAOβ expression in stomatal guard cells of the stressed AtCuAOβ-promoter::GFP-GUS plants, supporting its role in stomatal movement control. Coherently, herein reported results indicate the involvement of H2O2 delivered from AtCuAOβ-mediated PA catabolism in MeJA- and wound-induced stomatal closure. As concerns shorter time responses, interestingly WT plants respond to leaf or root wounding both with a local and systemic signalling, revealing the occurrence of a distal-tissues responses in AtCuAOβ-dependent way, as evidenced by the unresponsiveness of Atcuaoβ mutants to the same conditions of treatment. Overall, these results support the AtCuAOβ involvement in MeJA/wounding-induced stomatal closure with a dynamic implying extremely rapid long-distance root-to-leaf communication and could allow us to hypothesize a local and systemic action of AtCuAOβ related to water balance homeostasis regulating stomatal closure. As concerns the shoot-to-root long distal communication, analyses herein reported on root growth, protoxylem position and meristem size in cotyledonary leaf-wounded WT plants, show a DMTU-reversible early root-protoxylem differentiation occurring after the injury, with no observable changes in meristem size and root growth, confirming the involvement of AtCuAOβ in xylem differentiation which occurs under stress conditions, such as wounding. As a whole, the expression of AtCuAOβ in tissues or cell types regulating water supply and water loss such as xylem and stomata guard cells, with its role in protoxylem differentiation and in wound-induced stomatal closure suggests a role in water balance homeostasis by modulating coordinated adjustments in anatomical and functional features of xylem tissue and guard cells aperture levels in wounded plants. As concerns AtCuAOδ, data show that is up-regulated by ABA and that two Atcuaoδ insertional mutants are less responsive to this hormone, showing reduced ABA-mediated stomatal closure and H2O2 accumulation in guard cells as compared to the WT plants. Furthermore, CuAO inhibitors, as well as the H2O2 scavenger N,N1-dimethylthiourea, reversed most of the ABA-induced stomatal closure in WT plants. Tacking together, data suggest that AtCuAOδ is involved in the H2O2 production related to ABA-induced stomatal closure. Analysis herein reported of quantitative and tissue-specific gene expression performed by RT-qPCR and GUS-staining under stress conditions or after treatments with hormones or PAs, revealed that AtCuAOα2, AtCuAOα3, AtCuAOγ1 and AtCuAOγ2 expression was induced during dehydration recovery, wounding, treatment with IAA and Put. Moreover, the expression of these four genes in vascular tissues and hydathodes involved in water supply and/or loss, along with a dehydration-recovery dependent gene expression, would suggest a role in water balance homeostasis. In addition, occurrence in zones where an auxin maximum has been observed along with an IAA-induced alteration of expression profiles, support a role in tissue maturation and xylem differentiation events.
Le poliammine (PA) sono composti alifatici a basso peso molecolare presenti in tutti gli organismi viventi ed essenziali per la crescita e il differenziamento cellulare. La fine regolazione delle loro vie biosintetiche e cataboliche, nonché i processi di coniugazione e trasporto, assicurano il mantenimento dell'omeostasi dei livelli cellulari delle PA, supportando la rilevanza biologica di questi composti. Nelle piante, le PA più comuni sono la triamina spermidina (Spd), la tetramina spermina (Spm) e il loro precursore diamminico putrescina (Put). Per quanto riguarda il loro ruolo fisiologico, è stato riportato che le PA svolgono ruoli importanti in molti processi di sviluppo, tra cui la morfogenesi, la crescita, il differenziamento e la senescenza. Le PA sono catabolizzate da due classi di enzimi appartenenti alla famiglia delle ammine ossidasi (AO), le poliammino ossidasi monomeriche contenenti FAD (PAO) e le ammino ossidasi omodimeriche contenenti rame (CuAO). Nell'organismo modello Arabidopsis thaliana, sono presenti dieci geni putativi annotati come CuAO (AtCuAO), di cui solo quattro sono stati caratterizzati per la specificità del substrato, la localizzazione subcellulare e la regolazione dell'espressione genica: AtCuAOβ (precedentemente AtAO1; At4g14940) e AtCuAOγ1 (precedentemente AtCuAO1; At1g62810) con localizzazione apoplastica, AtCuAOα2 (precedentemente AtCuAO8; At1g31690), AtCuAOα3 (precedentemente AtCuAO2; At1g31710) e AtCuAO (precedentemente AtCuAO3; At2g42490) con localizzazione perossisomiale, tutte ossidano la Spd a livello del gruppo amminico primario con un'affinità paragonabile a quella della Put (AtCuAO1, AtCuAO2 and AtCuAO3) o di poco inferiore (AtCuAO and AtCuAO). Oltre a regolare la concentrazione delle PA nelle cellule vegetali, le AO contribuiscono ad importanti processi fisiologici attraverso i loro prodotti di reazione, fra i cui l’H2O2, composto condiviso in tutte le reazioni catalizzate dalle AO che svolge un ruolo chiave durante i processi di sviluppo e nelle risposte di difesa contro gli stress biotici e abiotici. Nel dettaglio, le AO localizzate nella parete cellulare sono coinvolte nelle risposte di difesa (sia costitutive, sia inducibili) contro gli stress biotici, inducendo eventi di irrigidimento della parete attraverso la produzione di H2O2 nell’apoplasto, e rappresentano quindi dei mediatori coinvolti nelle fasi finali di differenziazione dello xilema, nella deposizione della parete secondaria e nei processi di morte cellulare programmata. Inoltre, in risposta agli stress biotici e abiotici, l’ABA induce la produzione di H2O2 nelle cellule di guardia portando alla chiusura stomatica. Nonostante una fonte indiscussa di H2O2 nella parete cellulare delle cellule di guardia sia rappresentata dalle NADPH ossidasi della membrana plasmatica, recentemente è stato dimostrato che anche l'H2O2 prodotta dall’ossidazione delle PA può essere coinvolta in questo processo. Lo scopo del presente lavoro è stato quello di evidenziare i ruoli fisiologici svolti dall’ossidazione delle PA mediata da sei CuAO di Arabidopsis (codificate dai rispettivi geni AtCuAOα2, AtCuAOα3, AtCuAOβ, AtCuAOγ1, AtCuAOγ2 e AtCuAOδ) nelle risposte allo stress. A tal fine, sono state analizzate piante transgeniche di Arabidopsis esprimenti i costrutti AtCuAO::proteina fluorescente verde-β-glucuronidasi (GFP-GUS), nonché mutanti inserzionali con perdita di funzione Atcuaoβ e Atcuaoδ. In particolare, al fine di porre le basi per future ricerche sui ruoli fisiologici delle AtCuAO, è stato svolto uno studio completo dei pattern di espressione delle sei AtCuAO in studio mediante analisi quantitative (RT-qPCR) e approcci qualitativi (piante transgeniche AtCuAO-promotore: GFP-GUS), in piante trattate con diversi ormoni legati allo stress (ABA, MeJA, SA) e IAA, e in piante sottoposte a stress abiotici come la ferita e la disidratazione. Per quanto riguarda i ruoli fisiologici, l'espressione riportata precedentemente di AtCuAOβ nelle cellule di guardia, insieme alla sua espressione inducibile dal MeJA nei tessuti xilematici della radice, suggeriscono un ruolo di questo gene nei meccanismi omeostatici che portano a un equilibrio tra l'apporto idrico dipendente dallo xilema e la perdita d'acqua dipendente gli stomi in condizioni di stress. La chiusura stomatica può rappresentare una risposta rapida alle lesioni seguita dal rimodellamento del tessuto xilematico che consente l'acclimatazione delle piante in condizioni avverse. In considerazione di ciò, è stato studiato il coinvolgimento di AtCuAOβ nella chiusura stomatica e nel differenziamento dello xilema in piante sottoposte alla ferita della foglia o della radice, con particolare attenzione al suo possibile coinvolgimento nelle risposte sistemiche. Inoltre, il ruolo noto svolto dal vacuolo nella chiusura stomatica indotta dall'ABA, insieme al verificarsi di un'espressione di AtCuAOδ inducibile dall'ABA nelle cellule di guardia, ci hanno portato ad analizzare il possibile coinvolgimento dell’enzima vacuolare AtCuAOδ nel controllo del movimento stomatico. Per quanto riguarda AtCuAOβ, i dati qui riportati mostrato un aumento dei suoi livelli di espressione dopo la ferita sia della foglia, sia della radice e dopo il trattamento con il MeJA, ormone che segnala la ferita, supportando quindi un ruolo di primo piano di questa ammino ossidasi nelle risposte ai danni meccanici. Inoltre, i saggi istochimici svolti su piante prom-AtCuAOβ::GFP-GUS dimostrano che il trattamento con il MeJA, così come la ferita della foglia e della radice, inducono l'espressione di AtCuAOβ nelle cellule di guardia, supportandone il ruolo nel controllo del movimento stomatico. Coerentemente, i risultati di questo lavoro indicano il coinvolgimento dell’H2O2 prodotta dall’ossidazione delle PA mediata da AtCuAOβ nella chiusura stomatica indotta da MeJA e dalla ferita. Per quanto riguarda le risposte più brevi, è interessante notare che le piante WT rispondono alla ferita della foglia o della radice sia con una segnalazione locale che sistemica, rivelando il verificarsi di risposte AtCuAOβ-dipendenti nei tessuti distali, come è evidenziato dalla non responsività dei mutanti Atcuaoβ nelle stesse condizioni di trattamento. Complessivamente, questi risultati supportano il coinvolgimento di AtCuAOβ nella chiusura stomatica indotta dal MeJA e dalla ferita con una comunicazione radice-foglia a lunga distanza estremamente rapida. Questi dati ci permettono di ipotizzare un'azione sia locale che sistemica di AtCuAOβ nella regolazione dell'omeostasi del bilancio idrico mediato dalla chiusura stomatica. Per quanto riguarda la comunicazione distale fra foglia e radice, le analisi qui riportate sulla crescita delle radici, sulla posizione del protoxilema e sulla dimensione del meristema nelle piante WT ferite nell’aera fogliare, mostrano una differenziazione precoce del protoxilema reversibile dal trattamento con lo scavenger dell’ H2O2 DMTU, che si verifica dopo la ferita, senza comportare variazioni osservabili nella dimensione del meristema e nella crescita delle radici, confermando il coinvolgimento di AtCuAOβ nel differenziamento precoce dello xilema che si verifica in condizioni di stress, come appunto la ferita. Nel complesso, l'espressione di AtCuAOβ nei tessuti e nelle strutture che regolano l'approvvigionamento idrico e la perdita d'acqua come le cellule di guardia degli stomi e lo xilema, il suo ruolo nel differenziamento precoce del protoxilema e nella chiusura stomatica indotti dalla ferita, suggeriscono un ruolo di questo enzima nell'omeostasi dell'equilibrio idrico mediante la modulazione coordinata di riarrangiamenti anatomici e funzionali del tessuto xilematico e dei livelli di apertura delle cellule di guardia nelle piante sottoposte a ferita. Per quanto riguarda AtCuAOδ, i dati mostrano che la sua espressione genica è indotta dall’ABA e che i mutanti inserzionali Atcuaoδ risultano meno sensibili a questo ormone, mostrando una chiusura stomatica ridotta dopo il trattamento con ABA rispetto alle piante WT. Inoltre, gli inibitori delle CuAO, così come il DMTU, revertono quasi completamente la chiusura stomatica indotta dall'ABA nelle piante WT. Nel complesso, i dati suggeriscono quindi che AtCuAOδ è coinvolto nella produzione dell’H2O2 che media la chiusura stomatica indotta da ABA. Infine, i dati riportati delle analisi di espressione genica quantitativa e tessuto-specifica svolte tramite RT-qPCR e colorazione istochimica (GUS) in condizioni di stress o dopo i trattamenti con ormoni o PA, hanno rivelato che l'espressione di AtCuAOα2, AtCuAOα3, AtCuAOγ1 e AtCuAOγ2 è indotta in seguito alla disidratazione, alla ferita e al trattamento con IAA e la Put. L'espressione di questi quattro geni nei tessuti vascolari e negli idatodi, strutture coinvolte nell'approvvigionamento e/o nella perdita d’acqua, e l’induzione della loro espressione dopo disidratazione, suggeriscono un ruolo nell'omeostasi dell'equilibrio idrico. In aggiunta, la localizzazione riscontrata in zone in cui è stato osservato un massimo di auxina insieme all’induzione della loro espressione da parte dell’IAA, supportano un ruolo di questi enzimi nella maturazione dei tessuti e nel differenziamento dello xilema.
Access Rights: info:eu-repo/semantics/openAccess
Appears in Collections:Dipartimento di Scienze
T - Tesi di dottorato

Files in This Item:
File Description SizeFormat
Show full item record Recommend this item

Page view(s)

checked on Mar 23, 2023


checked on Mar 23, 2023

Google ScholarTM


Items in DSpace are protected by copyright, with all rights reserved, unless otherwise indicated.