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Title: Development of a new medical device for the diagnosis and management of Urinary Tract Infections (UTIs)
Authors: Murgia, Lorenza
Advisor: Antonini, Giovanni
Issue Date: 19-Feb-2020
Publisher: Università degli studi Roma Tre
Abstract: The onset of urinary tract infections (UTIs) follows the colonization and replication in the urinary tract of exogenous microorganisms, either bacteria or yeasts. This condition can be associated to a panel of symptoms, due to inflammatory processes, but a growing portion of infections are reported to be asymptomatic, especially when chronically present in vulnerable patients. UTIs are estimated to affect 150 million people worldwide every year, and have been drawing attention due to their high morbidity (and consequent healthcare-associated costs): UTIs are, in fact, among the most common infections both in the community (only second to respiratory tract’s) and in the hospital setting, where they reach 40% incidence. Women are more susceptible to UTIs compared to men: 40–50% of women worldwide experience this pathology at least once in their life, with recurrence occurring in 20% of cases. The most common causative agent both in non-complicated and in complicated UTIs is Escherichia coli, accounting for 70–95% of infections. The standard for the diagnosis of UTIs relies on urine culture (UC), which allows pathogen identification and subsequent antimicrobial susceptibility testing. After reception at the laboratory, urine samples are plated using a calibrated (0.010 ml) sterile loop on selected solid media, and thus incubated at 37°C for at least 24 hours. As a general rule, a UC is defined as positive if displaying at least 105 colony forming units (CFU)/ml; this threshold should however be considered flexible according to clinical picture (e.g. presence of catheter), peculiar patient characteristics (e.g. age) and detected microorganisms. Culture-positive samples are afterwards processed for susceptibility against a panel of antimicrobial compounds, providing clinicians with specific indications for treatment. Antimicrobial susceptibility testing (AST) is performed on isolated colonies through traditional disk diffusion or microdilution tests or, in high-paced facilities, using automated instruments such as VITEK® systems. This approach requires a considerable effort in terms of workload and up to 3 days to achieve results. In addition, it has been pointed out how preanalytical errors, due to sample incorrect handling, preparing or storage, may still notably affect the quality of laboratory diagnostics. Furthermore, since antibiotic treatment is generally started on empirical base awaiting laboratory results, this can lead to unnecessary/unsuccessful antimicrobial use which ultimately promotes the emergence of resistance. Patient care could greatly benefit from the development of a rapid, accurate, cost-effective diagnostic test that could be used directly in the site of need, possibly including pathogen identification along with antimicrobial susceptibility testing. To meet these needs, a number of point-of-care tests (POCTs) have been developed in the last decades. A POCT can be defined as a diagnostic test that can be performed at the patient bedside (i.g. at or near the location of the patient), notably at the site where care or treatment is provided, and more in general outside the centralized laboratory. Several POCTs have been developed to date for the diagnosis of UTIs, either culture-based or enzymatic, the first still requiring analytical times comparable to reference methods, the second significantly shortening the time of analysis but not always reaching comparable accuracy; none of these POCTs have yet found routine implementation in healthcare facilities. The Micro Biological Survey (MBS) method is a culture-based, colorimetric assay for both quantitative and qualitative microbiological analysis; detection of bacteria is based on measuring the catalytic activity of redox 3 enzymes of main bacterial metabolic pathways, allowing an unequivocal correlation between enzymatic activity and viable bacteria concentration in the samples. The features of this method suggest it holds promises also for its application to clinical diagnostic as a POCT, and preliminary encouraging results were obtained from pilot in vitro validation research and a previous clinical study, which highlighted the potential of this approach and showed the many possible applications of this technology. This PhD project followed from these initial results obtained applying the MBS method to urine analysis, and our research mainly focused on the optimization and the evaluation of the clinical performance of new medical devices based on the MBS method for the detection and management of UTIs. The performance of the MBS POCT devices for UTI detection and AST was evaluated again in a clinical setting against laboratory reference UC and antibiogram. The MBS devices tested displayed high accuracy, sensitivity and specificity compared to reference method, achieving a significant reduction in analytical time as complete results (detection of significant bacteriuria AND antimicrobial susceptibility profiling) were obtained within 8 hours. Such encouraging results suggest that the MBS POCTs may be applied to routine analysis at the patient bedside, yielding results within a working day and thus allowing a more rational workflow and reducing burden on central laboratories. The advent of such an accurate and robust POCT for UTI detection and management could allow a more rational screening before treatment or admission, also improving patient follow-up for treatment outcome evaluation; this POCT could also contribute to monitoring of antimicrobial prescribing performance and to the definition of local antibiotic resistance profiles. Further possible applications of the MBS method for the detection of UTIs were explored, in order to meet the different needs of specific frameworks and provide optimized diagnostic tools, also opening to volume miniaturization. In order to allow self-testing by non-professionals home-users, I investigated whether a miniaturized MBS device could be used for urine analysis at room temperature (18°C), so that a preventive UTI screening could be easily carried out in the home environment, without needing any additional thermostatic device. Self-samples urine was artificially contaminated with a panel of reference bacterial strains. Results were obtained for the tested concentrations (≥105 CFU/ml) between 1 minute and 5 hours. On the other hand, considering big hospitals’ pace, the MBS method was applied to a miniaturized, high-throughput support (48-wells microtiter plate), opening to customization and allowing processing of many urine samples at the same time, with a space-saving device and a simple procedure. This device is designed to perform detection of significant bacterial load and antibiotic susceptibility testing simultaneously on up to six urine samples at the same time. The performance of this device was tested through preliminary in vitro research, using overnight cultures obtained from 6 different uropathogen strains and a panel of three antibiotics. Results were obtained by eye within 8 hours at bacterial concentrations of interest (≥105 CFU/ml). Complete correspondence with reference antibiogram was not obtained, supposedly due to bias in antibiogram traditional protocol (selection of colonies) and underestimation of polymicrobial infections, whereas the MBS method, performed on urine samples directly, evaluates total bacterial flora’s susceptibility. 4 As an additional diagnostic implementation of the MBS method, our research focused on the development of a self-testing device for the evaluation of Candida albicans in urine samples. Candida is the most common yeast found in the urinary tract; in particular, C. albicansis an opportunistic pathogen that can be often involved in the onset of UTIs and accounts for 10-20% of nosocomial candiduria. The aim of our research was to develop an MBS medium for the selective growth of Candida spp. and provide a proof of concept for the application of the MBS method to the detection of C. albicans directly in urine samples, suggesting an application as a self-testing device designed for room temperature incubation. An original medium was developed, and sensitivity and selectivity were assessed in vitro against C. albicans and selected reference bacterial strains. The encouraging results obtained led us to test the method on artificially contaminated urine samples, yielding 75% accuracy; this partial agreement could be due to the difference in inoculum volume between the MBS and the reference methods. Moreover, a preliminary definition of a machine-learning scoring algorithm for the diagnosis of UTIs was proposed. Predictive clinical scores are designed to enable health care professionals to recognize and stratify “at risk” patients and trigger downstream actions, so that early intervention can help to prevent deterioration. Despite the emergence of clinical scores for several pathologies, to date no clinical score for the management of UTI has been defined and implemented alongside with routine protocols. Nevertheless, this could have a remarkable impact in everyday clinical practice. The aim of this work was to develop a machine learning based clinical score to rapidly stratify patients with suspected UTI into risk categories according to their higher or lower probability of infection, to ultimately provide clinicians with a simple tool to streamline therapeutic pathways and simplify operating protocols. In order to improve the predictive value of the score, together with clinical factors emerging from medical history and examination, results of laboratory tests were included in the analysis as important parameters to support diagnosis; results of the alternative method MBS POCT were included in the analysis on a par with standard microbiological and chemical-physical assays. Two machine learning models were applied: a Decision Tree algorithm and a Naive Bayes approach. The MBS POCT predictive ability has been confirmed against the other attributes considered in this analysis. When considering all available attributes, including MBS POCT results, no performance increase was achieved compared to MBS POCT results only, supporting the good predictive value of the MBS POCT alone and the limited significance of UTI indicators suggested by various international guidelines, aligning with the existing literature.
L’insorgenza di infezioni delle vie urinarie (IVU) è dovuta alla colonizzazione e alla replicazione, all’interno del tratto urinario, di microorganismi esogeni, sia di natura batterica che fungina. Questa condizione può essere associata ad un quadro sintomatologico più o meno specifico, ma una porzione crescente di infezioni si manifesta in maniera asintomatica, specialmente nel caso di condizioni di cronicità in pazienti particolarmente vulnerabili. Si stima che le IVU colpiscano 150 milioni di persone a livello mondiale ogni anno, e sono state oggetto di crescente attenzione da parte del mondo medico-sanitario a causa della loro morbilità (e dei conseguenti costi sanitari associati): le IVU sono difatti tra le più comuni infezioni sia in ambito comunitario (seconde solo alle infezioni del tratto respiratorio) che nosocomiale, dove raggiungono il 40% di incidenza. Le donne risultano maggiormente suscettibili alle IVU rispetto agli uomini: è stato stimato che il 40-50% delle donne a livello mondiale sia colpito da questa patologia almeno una volta nella vita, con eventi ricorrenti nel 20% dei casi. L’agente eziologico più comune sia in IVU complicate che non complicate è Escherichia coli, responsabile del 70-95% delle infezioni. Lo standard diagnostico per le IVU è basato sull’urinocoltura (UC), che consente l’identificazione dei patogeni e la conseguente verifica della loro suscettibilità ad antimicrobici. Una volta ricevuti dal laboratorio di analisi, i campioni urinari sono seminati, usando un’ansa calibrata (0.010 ml) sterile, su terreni agarizzati in piastre Petri, che sono, quindi, incubate a 37°C per almeno 24 ore. Come regola generale, una UC si definisce positiva se vengono rilevate almeno 105 unità formanti colonia (UFC)/ml; questo valore soglia deve essere, tuttavia, considerato flessibile a seconda dello specifico quadro clinico (es. presenza di catetere vescicale), delle particolari caratteristiche del paziente (es. età) e dell’agente microbico rilevato. I campioni positivi all’UC vanno poi incontro a valutazione della suscettibilità ad una serie di composti antibiotici (antibiogramma), fornendo ai clinici informazioni specifiche fondamentali ai fini del trattamento. L’antibiogramma viene eseguito, a partire da colonie isolate, mediante i metodi tradizionali della diffusione su agar o della microdiluizione, oppure utilizzando strumenti più o meno automatizzati, tra cui i sistemi VITEK®. Questo approccio comporta un carico di lavoro considerevole e fino a 3 giorni per ottenere risultati completi; di conseguenza, il trattamento antibiotico è generalmente definito su base empirica nell’attesa dei risultati del laboratorio. Questo può comportare un utilizzo di antimicrobici non necessario o inefficace, promuovendo, in ultimo, l’emergenza di antibiotico-resistenze. La cura del paziente potrebbe ricevere un miglioramento sostanziale dall’adozione di un test diagnostico rapido, accurato e dai costi contenuti, che possa essere eseguito nel sito di bisogno, possibilmente includendo l’identificazione dei patogeni insieme all’antibiogramma. Per rispondere a tale esigenza, negli ultimi decenni sono stati sviluppati vari point-of-care test (POCT). Un POCT può essere definito come un test diagnostico che può essere eseguito al letto del paziente (ovvero nel sito in cui si trova il paziente), dove viene fornito il trattamento, o più in generale al di fuori di un laboratorio centralizzato. Numerosi POCT sono stati proposti per la diagnosi delle IVU, sia colturali che enzimatici: i primi richiedono tempi analitici comparabili a quelli delle metodiche tradizionali, i secondi consentono una riduzione significativa del tempo di analisi ma non sempre raggiungono un’accuratezza paragonabile. Nessuno di questi POCT è stato finora implementato nelle analisi di routine all’interno di strutture di assistenza sanitaria. Il metodo Micro Biological Survey (MBS) è un metodo colturale colorimetrico che consente analisi microbiologiche sia quantitative che qualitative; il rilevamento dei microrganismi è basato sulla misura v dell’attività catalitica di enzimi ossidoreduttasici del metabolismo batterico primario, consentendo una correlazione univoca tra attività enzimatica e concentrazione di batteri vitali presenti nel campione. Le caratteristiche di questo metodo suggeriscono una sua promettente applicazione alla diagnostica clinica come POCT, e incoraggianti risultati preliminari sono stati ottenuti dalla sperimentazione per la sua validazione in vitro e da un primo studio clinico, che ha contribuito a mettere in luce il potenziale di questo approccio e a mostrare le altre numerose possibili applicazioni di questa tecnologia. Il presente progetto di Dottorato prende le mosse da questi risultati iniziali ottenuti applicando il metodo MBS all’analisi delle urine, e la presente ricerca si è incentrata principalmente sulla ottimizzazione e valutazione della performance di nuovi dispositivi per il rilevamento e la gestione delle IVU basati sul metodo MBS. La performance di due dispositivi MBS POCT per la diagnosi di IVU e per la valutazione della suscettibilità a antibiotici a partire da campioni urinari è stata valutata nuovamente in ambito clinico in riferimento ai metodi di riferimento dell’UC e dell’antibiogramma. I dispositivi MBS esaminati hanno mostrato elevate accuratezza, sensibilità e specificità in confronto ai metodi di riferimento, conseguendo una riduzione significativa del tempo d’analisi in quanto è stato possibile ottenere risultati completi (rilevazione di una batteriuria clinicamente significativa + profilazione della suscettibilità a antibiotici) nell’arco di 8 ore. Tali incoraggianti risultati suggeriscono che i due MBS POCT potrebbero trovare applicazione nell’ambito delle analisi di routine al letto del paziente, ottenendo risultati entro una giornata lavorativa e perciò consentendo una riduzione e razionalizzazione dei carichi di lavoro che gravano sui laboratori centrali. L’avvento di un tale POCT potrebbe consentire una migliore valutazione precedentemente alla somministrazione del trattamento o all’ospedalizzazione, migliorando, inoltre, il follow-up del paziente mediante la valutazione del successo del trattamento; questo POCT potrebbe, in ultimo, contribuire a monitorare la prescrizione di antimicrobici e partecipare alla definizione di profili locali di antibiotico-resistenza. Nel presente lavoro sono state esplorate ulteriori possibili applicazioni del metodo MBS per l’analisi di campioni urinari, al fine di rispondere ai bisogni di specifici contesti e fornire dispositivi diagnostici ottimizzati allo scopo, ponendo, inoltre, le basi per una miniaturizzazione dei volumi di analisi. Con l’obiettivo di consentire un’auto-analisi da parte di utilizzatori non professionali, ho valutato come un dispositivo MBS miniaturizzato potesse essere impiegato per l’analisi di campioni d’urina a temperatura ambiente (18°C), in modo da consentire di effettuare un controllo preventivo per una IVU direttamente in ambiente domestico, senza il bisogno di strumentazione aggiuntiva. I risultati sono stati ottenuti analizzando campioni di urina artificialmente contaminata, considerando una selezione di ceppi batterici di riferimento a concentrazioni di interesse (≥105 UFC/ml), in tempi compresi tra 1 minuto e 5 ore. D’altro lato, considerando i ritmi dei grandi ospedali, il metodo MBS è stato applicato a un supporto miniaturizzato ad elevata produttività (piastre per microtitolazione a 48 pozzetti), permettendo il processamento in parallelo di vari campioni di urina, mediante un protocollo semplice e un dispositivo dall’ingombro contenuto. Questo dispositivo è stato sviluppato per il simultaneo rilevamento di una batteriuria clinicamente significativa e valutazione della suscettibilità a antimicrobici su un massimo di 6 campioni contemporaneamente. La performance di questo dispositivo è stata esaminata nel corso di una preliminare sperimentazione in vitro, considerando 6 differenti ceppi di batteri uropatogeni e una selezione di 3 antibiotici. I risultati sono stati raccolti nell’arco di 8 ore considerando concentrazioni batteriche di interesse (≥105 UFC/ml). Non è stato possibile ottenere una corrispondenza vi completa con l’antibiogramma di riferimento, probabilmente a causa di un bias nel protocollo tradizionale relativo alla selezione di colonie e alla sottostima delle infezioni polimicrobiche (al contrario, il metodo MBS, effettuato direttamente sui campioni di urina, valuta le caratteristiche di suscettibilità dell’intera flora batterica presente nel campione). La presente ricerca si è inoltre incentrata sullo sviluppo di un dispositivo per il rilevamento di Candida albicans all’interno di campioni di urina, considerando un’ulteriore applicazione diagnostica del metodo MBS. Candida è il lievito più comunemente rilevato nel tratto urinario; in particolare, C. albicans è un patogeno opportunista che può essere spesso coinvolto nell’insorgenza di IVU ed è responsabile del 10-20% delle candidurie in ambito ospedaliero. Lo scopo di questa ricerca è stato quello di definire un reattivo MBS per la crescita selettiva di Candida spp. e verificare la possibilità di applicazione del metodo MBS al rilevamento di Candida spp. direttamente all’interno di campioni urinari mediante un dispositivo di auto-analisi per impiego in ambiente domestico a temperatura ambiente. È stato, quindi, messo a punto un reattivo MBS originale, e le sue caratteristiche di sensibilità e specificità sono state esaminate in vitro in riferimento a C. albicans e a selezionati ceppi batterici di riferimento. I risultati incoraggianti ottenuti in questa sperimentazione ci hanno portato a approfondire il comportamento del metodo utilizzando campioni di urina artificialmente contaminati, ottenendo un valore di accuratezza pari a 75%, influenzato probabilmente dalla differenza nel volume dell’inoculo tra i metodi MBS e di riferimento. In ultimo, è stata proposta la definizione di un algoritmo di scoring per la diagnosi di IVU basato sul machine learning. Gli score clinici predittivi sono sviluppati con l’intento di aiutare i clinici a riconoscere e stratificare pazienti “a rischio” per poi applicare procedure adeguate volte ad evitare il peggioramento delle condizioni del paziente. Nonostante l’emergenza di score clinici relativi a differenti patologie, ad oggi nessuno score clinico è stato definito e implementato per la gestione delle IVU. Obbiettivo di questa ricerca è stato quello di sviluppare uno score clinico basato sul machine-learning che possa consentire la rapida stratificazione dei pazienti con sospetto di IVU all’interno di categorie di rischio a seconda della loro maggiore o minore probabilità di infezione, per fornire al clinico uno strumento semplice per snellire le procedure diagnostiche. Al fine di migliorare il potere predittivo dello score, insieme a fattori emergenti dall’anamnesi e dall’esame obbiettivo del paziente, i risultati di laboratorio sono stati incluse nell’analisi come parametri di importante supporto alla diagnosi, insieme ai risultati ottenuti col dispositivo MBS POCT per la diagnosi di IVU. Due modelli sono stati applicati nel presente lavoro: un algoritmo decision tree e un approccio Naive Bayes; entrambi hanno confermato il valore predittivo dell’MBS POCT rispetto agli altri attributi considerati: non è stato riscontrato alcun miglioramento della performance considerando tutti gli attributi rispetto al solo esito dell’MBS POCT, convalidando i risultati ottenuti negli studi clinici e in linea con la limitata significatività degli indicatori di IVU proposti riportata in letteratura.
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