Study of the ordered domains of Huntingtin

Abstract

Huntington’s disease (HD) is a rare neurodegenerative and autosomal dominant disorder. The neuropathology of HD consists in the dysfunction and death of specific neurons within the brain. The most affected are the neurons of the striatum and the neurons that project from the cortex to the striatum. The symptoms vary between individuals but are usually characterized by a triad of motor, cognitive, and psychiatric symptoms. From its earliest stages, HD dramatically affects patients quality of life and prevents their functional abilities. Indeed, motor symptoms such as the choreiform movements and gait disturbances emerge early in the course of the disease while motor impairments occur in later stages. In many cases patients die because of fatal aspiration pneumonia. HD is caused by a mutation in the IT15 gene, located on chromosome 4. The result is the production of a mutant htt (mhtt) with an abnormally long polyglutamine (polyQ) repeat in the N-terminal that leads to htt aggregation into fibrils and a variety of other aggregates. Htt is a huge protein of 348 kDa and 3144 amino acids. The polyQ stretch, which begins at the 18th amino acid, is followed by a proline-rich domain (PRD). Downstream of the polyQ there are several HEAT repeats, sequences of 40 amino acids that consist of two antiparallel α-helices linked by a short loop. The HEAT repeats are packed together to form a flexible rod (denoted α-rod) and can act as a scaffold for diverse protein complexes and mediate inter- and intra-molecular interactions. Htt undergoes proteolysis at numerous sites, mostly found in disordered regions. It is subjected to various post-translational modifications, such as phosphorylation, acetylation, palmitoylation, ubiquitynation, and sumoylation. The protein is present predominantly in the cytoplasm of neurons and is enriched in compartments containing vesicle-associated proteins. Htt controls the transport of organelles, in axons and dendrites within neurons, in both the anterograde and retrograde directions. It is located not only in neurons but also at the spindle poles, mitotic spindles, and astral microtubules in dividing cells, where it regulates the cortical localization of proteins essential for mitotic spindle positioning. Further, htt mediates the transport of proteins required for ciliogenesis. It binds several proteins involved in endocytosis and that support membrane invagination and the assembly of the endocytosis vescicles coating mediated by clathrin. Htt may directly regulate autophagy and the transcription by the interaction with transcription factors and transcriptional regulators, and may also act as a transcriptional cofactor of itself. Different studies have shown that htt is essential for embryonic development and for the formation of the nervous system,for embryogenesis and development. Some studies indicate that htt is a regulator of tissue maintenance and that has a prosurvival role. Other experimental studies have highlighted a possible involvement of htt in the neuroprotective role mediated by the 17β-estradiol (E2), a sex steroid hormone that has a neurotrophic and neuroprotective role in several brain regions. E2 protective effects depend on the over-expression of neuroglobin (Ngb), a brain globin promoted by ERβ (estrogen receptor β). E2 stimulation induces the over expression of both htt and Ngb, promoting the formation of a htt/Ngb complex, by direct interaction or mediated by other interactors, at the mitochondrial compartment. However, how Ngb translocation to mitochondria occurs is completely unknown. Given a possible role of htt in vesicular trafficking, htt may be a putative Ngb carrier. Recently the structure of full-length human htt in a complex with HAP40 (Htt-associated protein 40) has been determined by cryo-electron microscopy but it lacks atomic details of several regions. Due to the lack of structural data, when this work began, the aim of this thesis has been that of obtaining information on the structure-function relationships of htt through a structural bioinformatics approach. Through the use of several methods that predict order and disorder within a given protein, five htt regions predicted to fold into ordered domains have been detected. Structural models of htt ordered domains have been proposed for the first time, leading to the identification of a previously undetected HEAT repeats region in the third ordered domain (hunt3) and providing a putative function for four out of the five domains. Hunt3 has shown structural similarity with a Karyopherin, a protein involved in nuclear import by interacting with GTP-binding proteins. Surprisingly, the analysis of the htt interactome has revealed that it interacts with several GTP binding proteins. Molecular docking simulations have confirmed that Hunt3 can be considered the putative interaction site between htt and G proteins. Among htt interactors, the G protein Gαo1 (encoded by the GNAO1 gene) is particularly interesting. In fact, different heterozygous mutations in the GNAO1 gene are the cause of a severe neurodevelopmental disorder, the epileptic encephalopathy type 17, which is characterized by symptoms similar to those observed in HD. In addition, the analyses of htt and Ngb interactome revealed that Gαo1 interacts both with htt and with Ngb. Molecular docking simulations indicated that a ternary complex between htt, Gαo1 and Ngb is plausible, leading to the hypothesis that G proteins mediate the interaction between htt and Ngb, and possibly the transport of the latter protein to mitochondria. The cryo-electron microscopy structure of htt evidences that the putative interaction site of hunt3 with the G proteins is occupied by an α-helix connected to the opposite side of the domain through disordered loop regions and stabilized by electrostatic interactions. Moreover, this α-helix contains two phosphorylation sites, whose function is not known, and a signature sequence shared with several G proteins. Molecular docking simulations have shown that when the α-helix is removed from the structure, G proteins can bind to htt by replacing the α-helix. To validate the hypothesis that the α-helix could act as a molecular switch for the binding to the G proteins when phosphorylation occurs, 0.5 μs molecular dynamics simulations of the hunt3 domain in different phosphorylation states have been performed. Preliminary results suggest that the phosphorylation of Ser1345 increases the flexibility of the entire hunt3 domain with respect to the wild type. An opposite effect is observed on the double phosphorylated domain. Thus, at variance to what has been hypothesized, only the phosphorylation on Ser might act as a positive regulator of htt binding to G proteins, while double phosphorylation would revert this effect. However, it must be taken into account that replicas of all systems are currently in progress and that molecular dynamics results have been obtained on an isolated domain of htt, and it cannot be excluded that this region displays a different behaviour in the context of the entire protein. Therefore, the outcome of this work is currently being validated experimentally by recombinant expression of hunt3 domain in E. coli and proteomic analysis of its interactome. Another line of research of this work has been the study of htt sequences and structures of less complex model organisms. The htt sequences of C. intestinalis and B. floridae have been analysed, identifying ordered domains and performing structure prediction. All the models have shown structural similarity with the human ones. Finally, an htt-like protein, not previously identified, has been detected for the first time in C. elegans.

La malattia di Huntington (HD) è una malattia neurodegenerativa a carattere autosomico dominante. La neuropatologia consiste nella morte dei neuroni dello striato e dei neuroni che proiettano dalla corteccia allo striato. La malattia determina un progressivo cambiamento della personalità, disfunzioni motorie e demenza, e può svilupparsi in adulti e bambini. Fin dalle prime fasi la malattia compromette la qualità di vita dei pazienti impedendo le loro capacità funzionali. Infatti, all’inizio è associata a progressivi disturbi emotivi, psichiatrici e cognitivi mentre negli ultimi stadi è caratterizzata da sintomi motori, demenza progressiva o una graduale perdita dei processi mentali coinvolti nella comprensione, nel ragionamento, nel giudizio e nella memoria. La maggior parte dei pazienti alla fine soccombe a causa di polmonite da aspirazione per difficoltà nella deglutizione. La malattia è causata da una mutazione nel gene IT15 localizzato nel braccio corto del cromosoma 4 che codifica per una proteina chiamata huntingtina (htt). La mutazione consiste nell’espansione della ripetizione del codone CAG, all’interno del gene che codifica per l’htt. Il codone CAG codifica per l’amminoacido glutammina, perciò l’espansione comporta un lungo tratto anomalo di glutammine responsabile dell’aggregazione dell’htt in fibrille. La proteina ha un peso molecolare di 348 kDa e 3144 amminoacidi. La regione N-terminale include il tratto di poliglutammine che è seguito da un dominio ricco di proline (PRD). A valle del tratto di poliglutammine ci sono diverse ripetizioni chiamate HEAT, sequenze di 40 amminoacidi costituite da due α-eliche unite da un corto loop e disposte a formare un bastoncello flessibile denominato α-rod. I domini HEAT possono agire come impalcatura per la formazione di complessi proteici e mediare interazioni intra- e inter-molecolari. L’htt è soggetta a proteolisi in numerosi siti, la maggior parte dei quali si trovano nelle regioni disordinate. Inoltre è soggetta a varie modificazioni post-traduzionali, tra cui fosforilazione, acetilazione, palmitoilazione, ubiquitinazione e sumoilazione. L’htt si trova principalmente nel citoplasma dei neuroni e nei compartimenti contenenti proteine associate a vescicole. È infatti coinvolta nel controllo del trasporto di organelli, sia retrogrado che anterogrado, negli assoni e dendriti. L’htt è localizzata non solo nei neuroni ma anche ai poli del fuso, nel fuso mitotico e nei microtubuli astrali delle cellule in divisione dove regola la localizzazione corticale di proteine essenziali per il posizionamento del fuso mitotico. L’htt media anche il trasporto di proteine, necessarie per la ciliogenesi, alla matrice pericentriolare, L’htt agisce da impalcatura per l’interazione di proteine coinvolte nell’endocitosi, regolando le prime fasi di rivestimento e invaginazione della membrana. Può regolare direttamente l’autofagia e la trascrizione attraverso l’interazione con attivatori trascrizionali e repressori, e può anche agire da fattore trascrizionale di se stessa. Differenti studi hanno mostrato che l’htt è essenziale per lo sviluppo embrionale, per la formazione del sistema nervoso per l’embriogenesi e lo sviluppo. Alcuni studi indicano che è anche un regolatore dell’omeostasi tissutale e che ha un ruolo antiapoptotico. Altri studi hanno evidenziato un possibile coinvolgimento dell’htt nel ruolo neuroprotettivo mediato dal 17-β estradiolo (E2). Gli effetti protettivi di quest’ultimo dipendono dalla sovraespressione della neuroglobina (Ngb), una globina del sistema nervoso regolata dal recettore β degli estrogeni. La stimolazione di E2 induce la sovraespressione sia dell’htt che della Ngb, promuovendo la formazione del complesso htt/Ngb nei mitocondri, dove la Ngb lega il citrocromo c, impedendone il rilascio nel citosol e la conseguente attivazione dell’apoptosi. Tuttavia, come avvenga la traslocazione della Ngb ai mitocondri non è ancora noto. Dato un possibile ruolo dell’htt nel traffico vescicolare, questa potrebbe essere un buon candidato al trasporto della Ngb ai mitocondri. L’elevato peso molecolare e le grandi dimensioni dell’htt impediscono la cristallizzazione e studi di diffrazione a raggi X. Solo recentemente la struttura è stata determinata in complesso con la proteina HAP40 attraverso crio-microscopia elettronica, anche se ci sono diverse regioni che mancano di dettagli atomici. A causa dell’assenza di dati strutturali sull’htt quando questo lavoro è iniziato, il principale scopo è stato quello di ottenere maggiori informazioni sulla struttura e funzione di questa proteina, utilizzando un approccio di tipo bioinformatico. Attraverso l’uso di diversi metodi che predicono l’ordine e il disordine strutturale di una proteina, sono state identificate 5 regioni dell’htt predette formare domini ordinati. Per la prima volta sono stati proposti modelli strutturali di questi domini, portando all’identificazione di una nuova regione contenente ripetizioni HEAT nel terzo dominio ordinato (hunt3). Una presunta funzione è stata predetta soltanto per 4 domini dell’htt. Hunt3 ha mostrato somiglianza strutturale con una carioferina, coinvolta nell’importo nucleare di proteine cargo attraverso l’interazione con proteine che legano il GTP (proteine G). Sorprendentemente, l’analisi degli interattori dell’htt ha rivelato che quest’ultima interagisce con proteine G. Simulazioni di docking molecolare hanno mostrato che hunt3 può essere il possibile sito di interazione tra l’htt e le proteine G. Tra gli interattori dell’htt, la proteina Gαo1 (codificata dal gene GNAO1), sembra essere particolarmente interessante. Infatti differenti mutazioni in eterozigosi nel gene GNAO1 causano una patologia caratterizzata da sintomi simili a quelli dell’HD. Da un confronto dell’interattoma dell’htt e della Ngb è emerso che la proteina Gαo1 interagisce sia con l’htt che con la Ngb. I risultati delle simulazioni di docking molecolare indicano che la formazione di un complesso ternario tra htt, Gαo1 e Ngb è plausibile, facendo ipotizzare che le proteine G possano mediare l’interazione tra htt e Ngb, e probabilmente il trasporto di quest’ultima ai mitocondri. La struttura dell’htt evidenzia che in hunt3, il sito di interazione predetto con le proteine G è occupato da un’α-elica, connessa al lato opposto del dominio da due loop disordinati e stabilizzata da interazioni elettrostatiche. Inoltre l’α-elica contiene due siti di fosforilazione, la cui funzione non è ancora chiara, e alcuni residui che sono conservati in diverse proteine G. Per validare l’ipotesi che l’α-elica possa agire da interruttore molecolare per l’interazione con le proteine G come conseguenza della fosforilazione, sono state eseguite simulazioni di dinamica molecolare (ciascuna di 0.5 μs) di hunt3 in differenti stati di fosforilazione. Risultati preliminari indicano che la fosforilazione del residuo S1345 aumenterebbe la flessibilità dell’intero dominio hunt3, mentre un effetto inverso si osserva quando il dominio è fosforilato su entrambi i siti. Contrariamente a quanto era stato ipotizzato, solo la fosforilazione sul residuo S1345 agirebbe da regolatore positivo del legame tra l’htt e le proteine G. Tuttavia bisogna considerare che le repliche delle simulazioni di tutti i sistemi analizzati sono attualmente in corso e che le simulazioni sono state eseguite unicamente su un dominio isolato della proteina. Non si può quindi escludere che tale dominio possa avere un comportamento diverso nel contesto dell’intera proteina. Pertanto il risultato di questo lavoro è attualmente in corso di validazione attraverso l’espressione ricombinante del dominio hunt3 in E. coli ed analisi proteomica dell’interattoma. Un’altra linea di ricerca ha riguardato lo studio della sequenza dell’htt in alcuni organismi modello quali C. intestinalis e B. floridae. Infine una proteina simile all’htt è stata identificata per la prima volta in C. elegans.