Monitoring Hepatitis E Virus and Coronavirus in animal reservoirs by classical molecular techniques and Next Generation Sequencing

Abstract

Il virus dell’Epatite E (HEV) e i Coronavirus sono virus a RNA a trasmissione zoonotica che negli ultimi anni hanno destato preoccupazione per la Sanità Pubblica poiché responsabili di patologie umane emergenti. Il virus dell’Epatite E è un virus a trasmissione oro-fecale responsabile, nell’uomo, di forme di epatite acuta con scarsa tendenza alla cronicizzazione. Negli animali, al contrario, l’infezione evolve in maniera asintomatica. Nei paesi in via di sviluppo, il virus è endemico ed è responsabile di vaste epidemie conseguenti alla contaminazione fecale delle acque potabili. Nei paesi industrializzati, i casi umani autoctoni, non riconducibili quindi a soggiorni in aree endemiche, derivano dalla trasmissione zoonotica dei virus da serbatoi animali rappresentati prevalentemente dai suini (principale serbatoio), dai cinghiali e dal cervo. I genotipi 3 e 4 (HEV-3 e HEV-4) sono zoonotici e i ceppi umani e animali presentano fino al 100% d’identità nucleotidica. Nei paesi industrializzati HEV si trasmette prevalentemente attraverso il consumo di carne o prodotti a base di carne (in particolare salsicce contenenti fegato) consumati crudi o poco cotti. In Italia, il genotipo 3 è stato identificato sia in casi umani, sia nei suini allevati e nei cinghiali. I Coronavirus infettano l’uomo e altre specie animali come pipistrelli, suini, bovini, gatti, ratti e molti altri ancora. Negli ultimi 10 anni due specie di Coronavirus sono risultate zoonotiche: il virus della Sindrome Respiratoria Acuta Grave (SARS) e il virus della Sindrome Respiratoria Medio Orientale (MERS) che hanno causato migliaia di casi di infezione e di morti in tutto il mondo. Studi filogenetici sui Coronavirus animali e umani hanno dimostrato che molte delle specie circolanti hanno avuto origine da ceppi circolanti nei pipistrelli, considerati il serbatoio principale. Il ciclo epidemiologico ha un ospite intermedio, la civetta delle palme per il SARS-CoV e i dromedari per il MERS-CoV, che ha il solo ruolo di amplificare la popolazione virale prima dell’adattamento finale del virus all’uomo. Dopo le epidemie di SARS e MERS, la sorveglianza dei coronavirus nei pipistrelli è aumentata in tutto il mondo. I coronavirus sono stati identificati anche nei pipistrelli Europei e Italiani rilevando la presenza di ceppi correlati sia a specie di coronavirus non zoonotici, sia a virus simili al SARS-CoV e MERS-CoV confermando i pipistrelli come animali serbatoio per questi ceppi. Il virus dell’Epatite E e alcune specie di Coronavirus sono ancora poco caratterizzati, in parte perché identificati di recente e in parte perché manca un sistema efficiente di crescita in vitro. Le informazioni genetiche disponibili su questi virus sono il risultato delle analisi filogenetiche condotte sulle sequenze virali necessarie a stabilire le relazioni evolutive tra i virus e la loro classificazione in specie per i Coronavirus e in genotipi ulteriormente divisi in sottotipi per HEV. Tuttavia, le sequenze disponibili sono ancora poche e per lo più rappresentate da porzioni corte del genoma e talvolta poco informative. Il nuovo metodo di sequenziamento chiamato Sequenziamento di Nuova Generazione – (NGS) offre la possibilità di acquisire un numero elevato di sequenze tali da permettere di ricostruire i genomi interi, con notevole risparmio di tempo e in modo indipendente dalla conoscenza a priori della specie virale coinvolta. Il principale obiettivo di questo lavoro è stato la ricerca dei virus dell’Epatite E e di Coronavirus in alcuni serbatoi animali, la caratterizzazione dei ceppi circolanti mediante sequenziamento e lo studio delle loro relazioni evolutive. Il protocollo di NGS utilizzato è stato sviluppato durante lo studio, sia nella parte di preparazione dei campioni sia nello sviluppo delle pipeline bioinformatiche per le analisi dei risultati. Il protocollo NGS applicato a due campioni di feci di suino positive per HEV-3 non è stato sufficientemente sensibile per poter ottenere un genoma completo su una matrice complessa come le feci. La sequenza del genoma è stata completata mediante tecniche convenzionali. I genomi completi dei due ceppi di HEV-3 sono stati caratterizzati mediante filogenesi, permettendo di stabilire la loro appartenenza a un nuovo sottotipo di HEV-3 denominato HEV-3l. I ceppi appartenenti a questo nuovo sottotipo sono stati identificati a oggi unicamente in Italia e in Francia e potrebbero quindi rappresentare un sottotipo virale che non si è adattato al suino in maniera definitiva e che ancora circola moderatamente nella popolazione suina. Un approccio simile è stato applicato per lo studio di ceppi di HEV-3 identificati in fegati di cinghiale. Nella fase preliminare di questo lavoro è stato condotto uno studio di sorveglianza sulla circolazione di HEV in popolazioni di cinghiali cacciati in alcune aree del sud dell’Italia. I ceppi di HEV-3 identificati (prevalenza media 13.7%) sono risultati, da una prima analisi di sequenza su regioni genomiche corte, non classificabili nei sottotipi di HEV-3 noti fino a quel momento. Gli RNA virali estratti dai fegati di cinghiale positivi per HEV-3 sono stati sequenziati mediante NGS. I genomi completi (7,2 kb) ottenuti sono stati analizzati mediante filogenesi. Uno dei ceppi ha mostrato un basso grado di relazione con altri ceppi di riferimento, appartenendo probabilmente a un nuovo sottotipo. Il secondo ceppo è stato invece classificato in un sottotipo già rilevato in precedenza in Europa nei cinghiali e in casi umani ma mai rilevato in Italia. Un secondo studio di sorveglianza molecolare è stato condotto su alcune popolazioni di cinghiali cacciati nella provincia di Viterbo. Il 52,2% dei fegati esaminati è risultato positivo alla ricerca del genoma di HEV-3. Lo studio di sequenza condotto sui ceppi identificati negli animali cacciati in diverse zone della provincia ha evidenziato la circolazione di più ceppi virali geneticamente distanti tra loro. Tuttavia, un unico ceppo virale (100% di identità nucleotidica) circolava tra gli animali appartenenti allo stesso gruppo familiare, cacciati dalla stessa squadra nel corso di uno specifico giorno di attività venatoria. In conclusione, i risultati ottenuti evidenziano il potenziale rischio di trasmissione zoonotica confermato dalla stretta vicinanza genetica tra i ceppi virali identificati nei serbatoi animali e quelli che sono stati identificati in casi umani. Per caratterizzare le specie di Coronavirus circolanti nelle popolazioni di pipistrelli in Italia il primo protocollo di NGS è stato applicato per il sequenziamento di ceppi identificati in pipistrelli provenienti dall’Emilia-Romagna. Il protocollo NGS è stato applicato all’RNA estratto da 3 campioni fecali e 2 carcasse positivi, rispettivamente, per Alpha e Betacoronavirus, ottenendo la sequenza completa dei genomi virali (30kb). I due ceppi virali identificati nella specie Pipistrellus kuhlii e Hypsugo savii sono stati classificati in un’unica specie e hanno mostrato relazioni evolutive con i ceppi di MERS-CoV confermando la circolazione anche in specie di pipistrelli presenti nel territorio italiano. Inoltre la presenza di un’unica specie (MERS-CoV) di Coronavirus in due pipistrelli di specie e genere diversi suggerisce l’adattamento del virus a due specie animali che occupano situazioni ambientali differenti essendo i pipistrelli Pipistrellus kuhlii legati alle aree agricole ed urbane mentre le specie Hypsugo savii a quelle rurali. I tre ceppi rilevati nei pipistrelli della specie Pipistrellus kuhlii sono stati invece classificati in due nuove specie di coronavirus mai rilevate in precedenza e hanno mostrato elevata divergenza nucleotidica con ceppi di coronavirus umani e di pipistrello. Queste analisi hanno confermato l’eterogeneità dei coronavirus confermando la presenza di due specie virali differenti in grado di infettare la stessa specie di pipistrelli. Per migliorare il protocollo di NGS cercando di ottenere una sensibilità maggiore e una maggiore accuratezza del risultato attraverso un aumento della profondità di sequenziamento, è stato sviluppato un secondo metodo NGS basato sull’amplificazione dell’RNA virale target mediante coppie di primer disegnate sul genoma di diversi ceppi e sottotipi di HEV-3 e sulle sequenze della specie MERS-CoV. Il nuovo metodo ha permesso di ottenere il genoma completo di cinque ceppi virali appartenenti a diversi sottotipi di HEV-3, distanti tra di loro e scelti dal precedente studio di sorveglianza di HEV sui fegati di cinghiale. L’analisi filogenetica condotta sui genomi completi ha permesso di classificare due ceppi in sottotipi HEV-3 già noti e comuni nelle popolazioni di cinghiali. Mentre gli altri due ceppi hanno mostrato una scarsa correlazione con i ceppi HEV-3 noti e potrebbero rappresentare nuovi sottotipi di HEV-3. Il nuovo metodo è stato testato inizialmente su un isolato cellulare di MERS-CoV permettendo il sequenziamento del genoma virale completo del ceppo. Per valutare la robustezza del metodo, questo è stato applicato su campioni di campo provenienti da pipistrelli. In questo reservoir sono stati ad oggi identificati solo ceppi correlati, definiti MERS-CoV like, ma non identici al MERS-CoV identificato nell’uomo. Il protocollo ha permesso il sequenziamento del genoma completo dei ceppi coinvolti nonostante la divergenza genetica con quello del MERS-CoV. Questo nuovo approccio ha dato risultati ottimali, infatti sono stati ottenuti i genomi completi sia di ceppi di HEV-3 appartenenti a diversi sottotipi sia di ceppi appartenenti alla specie MERS-CoV tra loro divergenti. Questo fa pensare al possibile utilizzo del pannello di primer e del metodo anche per la diagnostica di questi virus. Inoltre, rispetto al protocollo applicato in precedenza, l’accuratezza del risultato è stata elevata consentendo di ottenere un numero elevato di sequenze specifiche virali. Il lavoro descritto in questa tesi ha avuto l’obiettivo generale di monitorare e caratterizzare ceppi di virus zoonotici (HEV) o potenzialmente zoonotici (Coronavirus) circolanti, in Italia, in alcune specie animali e valutarne le relazioni evolutive mediante analisi filogenetiche sulle sequenze. I risultati hanno permesso di identificare nuovi sottotipi del genotipo zoonotico HEV-3 e nuove specie di Coronavirus mai identificati in precedenza. Inoltre, il metodo di NGS sviluppato (sequenziamento e pipeline bionformatica) ha dato risultati ottimali, migliorabili nella fase iniziale di arricchimento delle sequenze virali e sarà utile nella sorveglianza in ambito animale e umano delle infezioni da parte di HEV e MERS-CoV.