Selective modulation of the estrogen receptor α levels and degradation in breast cancer

Abstract

The hormone 17β-estradiol (E2) controls several physiological functions such as cell proliferation through the estrogen receptor alpha (ERα). E2 simultaneously induces ERα degradation to balance cell hormone-receptor availability, and triggers cell proliferation. ERα intracellular levels are finely regulated by E2 through the proteasome-mediated ERα degradation and via genetic/epigenetic mechanisms. However, external factors can modulate ERα content and impair E2:ERα physiological signaling. Indeed, the artificial ERα manipulation (i.e., over expression in receptor-devoid cell lines or ERα gene silencing in ERα-expressing cells) causes E2 insensitivity and cell death. Exogenous ERα inhibitors such as 4OH-tamoxifen and ICI (ICI182, 780/fulvestrant), induce respectively, an ERα accumulation or reduction preventing E2-induced cell proliferation. Previous data obtained in our laboratory demonstrated that chloroquine, a lysosomal inhibitor, increased ERα levels and blocked cellular proliferation. Moreover, the selective depletion of clathrin (CHC), a protein involved in endocytic process, decreased ERα levels and inhibited cell proliferation. This evidence demonstrated that lysosome was another ERα degradative pathway and that CHC endocytic pathway (i.e. a pathway unrelated to ERα) was a new mechanism involved in the control of ERα levels and E2-dependent proliferation. Therefore, overall data demonstrate that the control of ERα levels is intrinsically connected to E2-induced cellular proliferation. However, the molecular mechanisms regulating this network are still unknown. A de-regulation of the physiological control of ERα intracellular content can cause many pathologies including breast cancer (BC), in which ERα is considered the major driver of progression and it is the main pharmacological target in 80% of BCs. Remarkably, our hypothesis is that ERα has an intrinsic weakness because any factor which is able to change ERα amount can impair, at the same time, E2 proliferative signaling involved in cell proliferation. Therefore, the main goal of the three years PhD project is to identify novel pathways or molecules that modulate ERα content and, as a consequence, E2-dependent cell proliferation. To this purpose, the specific aims of the following work are: i) to assess the impact of other degradative and endocytic pathways on ERα levels and E2 cell proliferation, ii) to analyse the effect of a library, composed by different bioactive compounds on the modulation of ERα intracellular levels and E2-induced cell proliferation using the conventional western blotting (WB) technique and, iii) to set up new high-throughput techniques to evaluate the modulation of ERα content and E2-dependent proliferation by different compounds. Results identified caveolins (i.e., caveolin-1 and 2) and dynamin II–regulated pathways, which are not mainly related to ERα, as new endocytic pathways involved in both the E2:ERα signaling and involved in the regulation of receptor intracellular abundance. We also discovered that autophagy is a new ERα degradative pathway. We then set up three distinct kinds of screening methods; the ‘conventional WB’ screening and two high throughput methods, in-cell WB/PI screening and in-silico iLINCS-based screening. Through these three different methods we discovered many novel compounds (i.e., emetine, carfilzomib, methotrexate, mitoxantrone and thioridazine) that through their related pathways interfere with E2:ERα signalling and modulate receptor levels. Overall these data prove that, at the cellular level, there is a strict integration between the control of ERα intracellular concentration and E2-dependent physiological effects and further indicate that the compound-specific cellular targets are novel proteins involved in the regulation of ERα levels and in the E2:ERα signaling that controls cell proliferation.

L’ormone 17β-estradiolo (E2) regola diversi processi fisiologici tra cui la proliferazione cellulare attraverso il legame con il recettore degli estrogeni alpha (ERα). Il E2 provoca contemporaneamente sia la degradazione del recettore ERα, evento necessario per bilanciare la quantità del complesso ormone:recettore nelle cellule, sia la proliferazione cellulare. I livelli intracellulari del ERα sono finemente regolati dall’ormone E2 sia attraverso la degradazione proteasomale del recettore che attraverso meccanismi genetici ed epigenetici. Tuttavia, fattori esterni possono modulare i livelli proteici del ERα ed andare ad impattare sul meccanismo d’azione regolato dal complesso E2:ERα. Infatti, la manipolazione artificiale del ERα, ovvero l’over espressione del ERα in cellule prive di tale recettore oppure il silenziamento genico del ERα in cellule esprimenti il ERα, causa, in entrambi i casi, insensibilità al E2 e morte cellulare. Inibitori esogeni del ERα, come ad esempio il 4OH-tamoxifene e l’ICI (ICI182, 780 o fulvestrant), provocano, rispettivamente, un accumulo o una riduzione del ERα, prevenendo, in entrambi i casi, la proliferazione cellulare indotta dal E2. Dati precedenti, ottenuti nel nostro laboratorio, hanno dimostrato che la clorochina, un inibitore del lisosoma, aumentava i livelli proteici del ERα e bloccava la crescita cellulare. Inoltre, il silenziamento della clatrina (CHC), una proteina coinvolta nei processi endocitici, diminuiva i livelli del ERα ed inibiva la proliferazione cellulare. Quanto sopra ha dimostrato che il lisosoma era un altro meccanismo di degradazione recettoriale del ERα ed inoltre, che l’azione della CHC era coinvolta nella regolazione dei livelli del ERα e nella proliferazione indotta dal E2. Complessivamente, i dati dimostrano quindi che il controllo dei livelli intracellulari del ERα è intrinsecamente correlato alla proliferazione cellulare generata dal E2. Ciò nonostante, i meccanismi fini che regolano tale interconnessione sono ancora ignoti. La de-regolazione del controllo dei livelli intracellulari del ERα può causare diverse patologie tra cui il cancro al seno (BC), patologia in cui il recettore ERα è considerato il fattore maggiormente responsabile della progressione del tumore ed è infatti il bersaglio farmacologico principale nell’80% dei casi di tumore al seno. Quindi, la nostra ipotesi è che il recettore ERα possieda una debolezza intrinseca, dovuta al fatto che, qualunque sia il fattore in grado di modulare i suoi livelli intracellulari, esso può contemporaneamente interferire sulla proliferazione cellulare regolata dal E2. Pertanto, lo scopo principale dei tre anni di dottorato è quello di indentificare nuovi meccanismi cellulari o nuove molecole che modulino il contenuto cellulare del ERα e, di conseguenza, la proliferazione indotta dal E2. A tal proposito, i vari scopi della tesi sono: i) studiare l’impatto di altri meccanismi degradativi ed endocitici sui livelli del ERα e sulla proliferazione indotta dal E2, ii) analizzare l’effetto di una collezione di composti bioattivi sulla modulazione dei livelli intracellulari del recettore ERα e sulla crescita cellulare regolata dal E2 tramite la tecnica convenzionale di western blotting (WB), iii) impostare nuove tecniche avanzate per valutare come differenti composti modulino i livelli del ERα e la proliferazione cellulare stimolata dal E2. I risultati ottenuti indicano che i meccanismi cellulari, non principalmente correlati al recettore ERα, ovvero quelli regolati sia dalle caveoline (caveolina 1 e 2) che dalla dinamina II, sono nuovi processi endocitici coinvolti nella trasduzione del segnale del complesso E2:ERα e nella regolazione dei livelli intracellulari del recettore ERα. Abbiamo inoltre dimostrato che l’autofagia è un nuovo meccanismo di degradazione recettoriale del ERα. Infine, abbiamo sviluppato tre differenti metodi di valutazione: un metodo di screening basato sulla tecnica convenzionale di WB e due metodi ‘high-content’ quali “in-cell WB/PI screening” e “in-silico iLINCS screening”. Complessivamente i tre metodi ci hanno permesso di identificare nuovi composti quali: l’emetina, il carfilzomib, il methotrexato, il mitoxantrone e la tioridazina che sono in grado di modulare i livelli del ERα e di interferire con la trasduzione del segnale del complesso E2:ERα che regola la proliferazione cellulare. In conclusione, i dati ottenuti confermano quindi che il controllo dei livelli intracellulari del ERα e gli effetti fisiologici regolati dall’ormone E2, sono strettamente interconnessi a livello cellulare e ulteriormente dimostrano come i bersagli cellulari dei composti identificati siano nuove proteine coinvolte nella trasduzione del segnale del complesso E2:ERα che regola la proliferazione cellulare.