A dual-trap optical tweezer setup for single molecule manipulation : development and testing

Abstract

Tradizionalmente, gli esperimenti di chimica e biologia hanno coinvolto quantità macroscopiche di molecole (moli o grammi) della stessa specie. Questi esperimenti, che hanno contribuito a sviluppare i fondamenti della termodinamica e della meccanica statistica, provano le proprietà di un insieme di molecole, ed i risultati cosi' ottenuti rivelano i valori medi su tale insieme. A complemento di questi esperimenti, negli ultimi due decenni si sono sviluppati sistemi sperimentali per misurare le proprietà di un' unica molecola alla volta, ottenendo informazioni non mediate. Questa nuova classe di esperimenti permette, per esempio, di misurare direttamente le fluttuazioni conformazionali in un unico biopolimero o la distribuzione delle dimensioni dei passi di un motore molecolare [1]. Si e' anche data la possibilità di studiare il comportamento di queste molecole in condizioni di stress meccanico (Force Spectroscopy Tecniche, FST). Le pinze ottiche sono un esempio di FST. In questo caso una molecola, come un biopolimero, è chimicamente fissato a due sferule dielettriche di raggio micrometrico, che vengono poi manipolate per pressione di radiazione. E' quindi possibile strudiare l'elasticita' non lineare dei biopolimeri, misurando la forza esercitata sul polimero in funzione della distanza tra le due trappole (curva forza-distanza, FEC), con una risoluzione al di sotto del pico Newton in forza e del nanometro in distanza. Tra le diverse possibili configurazioni sperimentali per pinze ottiche, si distinguono le configurazioni in cui entrambe le estremità della molecola vengono manipolate da due trappole ottiche indipendenti e quelli in cui una delle due estremità è ancorato, come il sistema già in uso nello Small Biosystems Lab presso l'Università di Barcellona [2]. Molti dei più recenti risultati nel campo della biofisica singola molecola sono stati possibili grazie a sistemi sperimentali che funzionano con due trappole ottici indipendenti [3,4,5]. Questi sistemi hanno due caratteristiche salienti: da un lato questi strumenti permettono la manipolazione di una singola molecola usando solo fasci di luce, garantendo un migliore isolamento dal rumore ambientale, d'altro canto, questi strumenti possono misurare due segnali, uno per ogni trappola, e dare l'accesso ai cross-correlazione tra le forze in due punti del sistema sperimentale, una quantità che può fornire informazioni fisicamente rilevanti, non ottenibili con una trappola unica. Il nuovo set-up è stato sviluppato a partire da un setup sperimentale gia' in uso nel laboratorio. Cambiando il materiale delle sferule utilizzate per l'accoppiamento dei fasci di luce alla molecola con uno a piu' basso indice di rifrazione, abbiamo dimostrato la possibilità di utilizzare la stessa ottica per formare una singola trappola con due fasci contropropaganti o due trappole indipendenti. Lo sviluppo del sistema a due trappole ha richiesto anche la definizione di un nuovo protocollo di calibrazione e nuovi metodi di analisi dei dati basati sulla meccanica statistica, con particolare attenzione allo studio delle correlazioni incrociate. Per verificare il corretto funzionamento delle due trappole sono stati ripetuti alcuni degli esperimenti riportati in letteratura. Questi esperimenti sono descritti in dettaglio nel terzo capitolo della tesi. In primo luogo abbiamo riprodotto i risultati di H.C. Meiners S. Quake [3], misurando le correlazioni idrodinamiche tra due sfere intrappolate in trappole ottiche. Le correlazioni idrodinamiche si manifestano attraverso un minimo nella funzione di cross-correlazione tra le fluttuazioni di forza misurate nelle trappole. Un secondo esperimento consiste nella misurara della rigidità di molecole di DNA .I n un sistema con due trappole, la rigidita' puo' essere misurata direttamente dalle fluttuazioni. In questo caso si è verificato che il sistema descritto in questa tesi puo' esplorare una regime di forze (1-20 pN) piu' ampio di quelli riportati nella letteratura relativa a questo problema [6.7] (fino a 10 PN). In un terzo esperimento e' stata misurata la termodinamica e la cinetica di ripiegamento di un hairpin di DNA. Un hairpin di DNA e' una struttura secondaria formate da sequenze palindromiche di DNA a singolo filamento [4]. Queste strutture sono un sistema modello che è stato ampiamente studiato negli ultimi anni per capire la termodinamica degli acidi nucleici, o per capire la fenomenologia di piegatura (folding) di biopolimeri. In questo caso gli esperimenti sono stati fatti utilizzando le due diverse configurazioni sperimentali, con uno o due trappole, per verificare che la termodinamica del processo di folding non è influenzata dalle interazioni tra l'hairpin e la materia costitutiva delle microsfere di silica. Inoltre, questo esperimento ha richiesto lo sviluppo di tecniche per ottimizzare il rapporto segnale-rumore, basate sull'uso della cross-correlazione tra i segnali emessi dai due trappole. Lo sviluppo del sistema di due trappole indipendenti è un primo passo nel quadro di un più ampio programma scientifico di ricerca sull' ugualianza di Jarzynski (JE). La JE e altre relazioni per sistemi non in equilibrio sono state studiate con le pinze ottiche negli ultimi anni [8]. La maggior parte di questi studi sono stati eseguiti su sistemi con una trappola unica. Il sistema di due trappole esplorerà nuove proprietà della JE, per esempio la non invarianza Galileiana, come spiegato nel quarto capitolo della tesi. Mentre gli esperimenti di non-equilibrio saranno effettuati dopo la conclusione della tesi, i fenomeni oggetto di studio sono modellate in dettaglio nei casi più semplici.